ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ АМИЛАЗЫ ШТАММА BACILLUS PARALICHENIFORMIS

Abstract

α-Амилазы (КФ 3.2.1.1) являются гидролитическими ферментами, расщепляющими гликозидные связи в молекулах крахмала, с образованием декстринов и олигосахаридов. Для промышленной переработки крахмала особый интерес представляют термостабильные микробные α-амилазы, которые используются для осахаривания и разжижения крахмала при температурах превышающих 70–75°С. Известно, что среди бациллярных α-амилаз часто встречаются термостабильные и щелочные α-амилазы. Целью работы является получение рекомбинантной α-амилазы из Bacillus paralicheniformis и изучение ее биохимических свойств.

Путем анализа полной последовательность генома штамма Bacillus paralicheniformis (GenBank NCBI, номер доступа CP124861) выбрана последовательность гена amyS, насчитывающая 1535 пар оснований. Биоинформатический анализ белкового продукта показал, что ген кодирует α-амилазу, содержащую сигнальный пептид MKQHKRLYARLLPLLFALIFLLPHSAAAA. Были подобраны олигонуклеотиды для клонирования гена без сигнального пептида. Клонирование гена amyS в векторе рЕТ-28с(+) проводили с использованием ферментов нуклеинового обмена по сайтам NdeI и NotI. Результирующий белковый продукт содержал гексагистидиновую метку. Трансформацией компетентных клеток Escherichia coli штамма ArcticExpress(DE3)RP был получен рекомбинантный штамм, продуцирующий α-амилазу rAmyS с молекулярной массой 58,8 кДа. Культура штамма была индуцирована изопропил-β-тиогалактопиранозидом в концентрации 0.25 мМ, что позволило провести внутриклеточное накопление рекомбинантного белка rAmyS. Клетки были лизированы лизоцимом, а рекомбинантный белок был выделен с помощью металлоаффинной хроматографии на ионах Ni²⁺.

Изучение биохимических параметров рекомбинантной α-амилазы показало, что фермент активен в температурном диапазоне от 55°С до 90°С с максимумом 85°С. Исследование термостабильности показало, что при инкубации при 70°С в течение 60 минут остаточная амилазная активность составляла 60% от максимального значения. После инкубации при 80°С в течение 60 минут остаточная амилазная активность составила 43%. Тестирование фермента в рН диапазоне с 4,0 по 11,0 показало, что оптимальным значением рН является 6,0. При изучении влияния ионов металлов на активность рекомбинантной α-амилазы установлено, что фермент обладает чувствительностью к Fe (III). В присутствии Fe³⁺ активность фермента уменьшается на 78,5%. Исследование амилолитической активности рекомбинантного фермента методом ДНС показало, что удельная активность рекомбинантного белка rAmyS составляет 421 Ед/мг. Методом тонкослойной хроматографии идентифицированы продукты гидролиза картофельного крахмала при его инкубации с рекомбинантной α-амилазой rAmyS при температуре 50°C и рН 7. Установлено, что ферментативный гидролиз крахмала при данных условиях протекает в течение первых 15 минут и основными продуктами гидролиза выступают: глюкоза, мальтоза, мальтотреоза, мальтотетраоза и мальтопентаоза. Таким образом, можно отметить, что α-амилаза из штамма Bacillus paralicheniformis вследствие своей высокой удельной активности, повышенной термостабильности, толерантности к ряду металлов, представляется перспективным ферментом для использования в технологиях гидролиза крахмала и крахмалсодержащего сырья.