ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ И ОПТИМИЗАЦИИ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM
Main Article Content
Authors
В. Ю. Кислицин
Институт молекулярной биологии и биохимии имени М.А. Айтхожина, Республика Казахстан, 050012, г. Алматы, ул. Досмухамедова, 86.
А.М. Чулкин
Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Российская Федерация, 119071, г. Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2
А. М. Рожкова
Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Российская Федерация, 119071, г. Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2
Abstract
Мицелиальный гриб P. verruculosum является сапрофитным грибом-целлюлолитиком. Ранее с помощью многостадийного неупорядоченного мутагенеза был получен промышленный штамм-продуцент целлюлазных препаратов B1-221-151, обладающий продуктивностью до 60 г секретируемого белка на литр культуральной жидкости. Основными ферментами его секретирумого комплекса являются целлобиогидролаза 1 и 2 (до 50%), эндоглюканазы (до 12%), β-глюкозидаза (до 4%), и ксиланазы. Также ранее из штамма B1-221-151, был получен рецепиентный штамм В1-537 с дефектом гена нитратредуктазы (niaD), что позволяет использовать его для получения препаратов гетерологичных ферментов. Получаемые таким образом ферментные препараты находят применение в сельском хозяйстве, текстильном производстве, биоконвесии растительных отходов и целлюлозо-бумажной промышленности.
Развитие метода геномного редактирования системой CRISPR/Cas дало мощный инструмент для дальнейшего изучения и оптимизации мицелиальных грибов для промышленных задач. Нами также была адаптирована методика геномного редактирования для мицелиального гриба P. verruculosum, позволяющая получать штаммы с нокаутами маркерного гена niaD и целевых генов. С помощью адаптированной методики нами было изучено влияние транскрипционных факторов Clr1, Clr2, XlnR, TacA и внутриклеточной β –глюкозидазы, Bgl2, на экспрессию целлюлаз в грибе P. verruculosum. Наиболее интересный эффект наблюдался при нокауте гена транскрипционного фактора TacA. Его нокаут привёл к увеличению целлобиогидролазной активности более чем в 4 раза, β-глюкозидазной активности в 2 раза, эндоглюканазной в 1,5 раза и ксиланазной более чем в 2 раза по сравнению со штаммом B1-221-151. Также новый штамм P. verruculosum может легко использоваться для экспрессии генов гетерологичных ферментов. Например, был получен штамм P. verruculosum dT16-13, экспрессирующий помимо собственных целлюлаз β-глюкозидазу Aspergillus niger. Гидролитическая активность ферментного препарата получаемого с помощью нового штамма значительно превосходит по гидролитической активности по целлюлозосодержащим материалам ферментный препарат продуцируемый штаммом B1-221-151. При этом выход глюкозы и восстанавливающих сахаров и глюкозы при гидролизе микрокристаллической целлюлозы достигает 60%, а при гидролизе измельчённой осины 40% и 58% соответственно, от изначальной массы субстрата за 48 часов.
Таким образом, адаптация метода геномного редактирования для мицелиального гриба P. verruculosum позволило решить как ряд фундаментальных задач, так и создать новый высокоэффективный реципиентный штамм.