НАРАБОТКА КОЗЬЕГО ХИМОЗИНА В УСЛОВИЯХ ГЛУБИННОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ В КЛЕТКАХ P. PASTORIS

Abstract

Химозин является основным ферментом, обладающим высокой степени специфичности по отношению к κ-казеину и вследствие этого используемым в сыродельной промышленности. В данной работе представлены результаты по экспрессии гена козьего прохимозина в дрожжах Pichia pastoris и изучении молокосвертывающей активности рекомбинантного козьего химозина. Ген козьего прохимозина был интегрирован в хромосомную ДНК дрожжей и путем метанольной индукции осуществлена секреция прохимозина в культуру дрожжей.

Биоинформатический анализ аминокислотной последовательности козьего прохимозина показал, что белок имеет один возможный сайт N-гликозилирования: Asp333-His334-Ser335. Молекулярная масса рекомбинантного козьего химозина, полученного в дрожжах определена методом электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле, составила 42 ± 1 кДа. Из данных следует, что N-гликозилирование увеличивает молекулярную массу примерно на 3 кДа, поскольку.предполагаемая молекулярная масса негликозилированного рекомбинантного химозина B из С. hircus составляет 38,6 кДа.

Чтобы проверить возможности масштабирования производства рекомбинантного химозина C. hircus, в биореакторе объемом 10 л культивировали P. pastoris трансформированный клон для ферментации дрожжевого штамма. Было обнаружено, что рост биомассы хорошо коррелирует с выходом ферментной активности. Использование оптимальных условий роста, среды роста YPD+CAS+BMz (10 г/л) позволило достичь 55 г массы сухих клеток после 96 ч роста штамма P. pastoris GS115/pPICZαA/CHproCYMB. Продукция белка началась с после 24 ч культивирования и достигло 145 Ед/мл. Максимальная скорость производства фермента 12 150 Ед/ч наблюдалась на третий день. После 96 часов роста не наблюдалось дальнейшего роста выработки химозина, что совпало с началом стационарной фазы роста.

После активации химозин очищали методом последовательной анионной и катионообменной хроматографии. Биохимическое изучение показало, что снижение молокосвертывающей активности фермента наблюдалось при повышении рН. Наибольшая активность рекомбинантного козьего химозина проявлялась при 60°С и рН 4,5-5,0 и составила 7680 ± 0,32 и 8727 ± 0,39 для коровьего и козьего молока, соответственно. Общая протеолитическая активность фермента составила 7769,2±0,38 Ед/мг. Полученные результаты позволяют предположить, что рекомбинантный козий химозин может быть использован в сыродельческой промышленности и имеет хорошие перспективы для практического применения при получении сыра из козьего молока.