ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММ-ПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ КОМБИНАЦИИ ТРЕХ НАИБОЛЕЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ TOXOPLASMA GONDII

Abstract

Токсоплазмоз - широко распространенная зоонозная инфекция, вызываемая внутриклеточным паразитом Toxoplasma gondii, поражающая людей и практически всех теплокровных животных. Токсоплазмоз поражает примерно треть населения земного шара. Это имеет огромное экономическое и социальное значение, влияющее на здоровье населения и животноводство. В основном заболевание протекает бессимптомно или может проявляться гриппоподобными симптомами и другими неспецифическими клиническими признаками. У сельскохозяйственных животных, в частности овец и коз, инфекция может привести к аборту, мумификации или мацерации плода, внутриутробной эмбриональной гибели, мертворождению или постнатальной смерти новорожденных, что угрожает выращиванию овец и коз во всем мире. Своевременная и точная диагностика T. gondii является ключевым фактором в эффективном контроле токсоплазмоза, как для населения, так и для животноводства. ИФА считается золотым стандартом и может быть использован как для обнаружения ранних антител класса IgM, так и более поздних антител класса IgG.

Применение рекомбинантных антигенов для диагностики токсоплазмоза позволяет повысить стандартизацию метода, поскольку антигенный состав точно известен. В одном тесте можно использовать два и более рекомбинантных антигена для повышения его чувствительности.

Целью данной работы явилось получение штамм-продуцента рекомбинантного химерного белка, состоящего из комбинации трех наиболее перспективных антигенов для диагностики токсоплазмоза коров, овец и коз.

В результате проведенных исследований был получен штамм-продуцент рекомбинантного химерного антигена, состоящего из последовательности белков SAG1, SAG2 и GRA7 T. gondii с молекулярной массой около 50 кДа. При оптимизации параметров культивирования штамм-продуцента, было установлено, что наиболее оптимальная концентрация изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида для экспрессии белка составляет 0,1 мМ, температура инкубации 25°С и время инкубации 5-6 часов. При этом, более длительная инкубация снижает экспрессию белка.

Очистку химерного белка из клеточного лизата осуществляли методом металл-аффинной хроматографии с помощью колонок His-Trap HP, в соответствии с наставлениями производителя. Установлено, что основной выход рекомбинантного химерного белка из колонки наблюдается при концентрации имидазола 500 мМ. Концентрацию белка в лизате и фракциях определяли по Бредфорду с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Максимальная концентрация очищенного белка T. gondii составила 1,2 мг/мл. Анализ аминокислотной последовательности очищенного рекомбинантного химерного белка методом масс-спектрометрии достоверно показал, что набор триптических пептидов соответствует белку Р30 T. gondii представленном в базе данных Mascot.

Таким образом в результате проведенных исследований получен рекомбинантный химерный белок, состоящий из иммунодоминантных участков трех белков T. gondii. В дальнейшем на основе данного белка будет проводиться работа по разработке иммуноферментного анализа для диагностики токсоплазмоза животных.