Разработка ПЦР тест-системы в режиме реального времени для идентификации Anaplasma marginale у крупного рогатого скота

Abstract

Anaplasma marginale – это грамотрицательная облигатная внутриклеточная бактерия, поражающая крупный рогатый скот, буйволов, оленей и антилоп, приводя к значительным экономическим потерям. Разработка молекулярно-генетических методов диагностики кровепаразитарных заболеваний является актуальным для принятия эффективных мер по предотвращению распространения клещевых инфекций. Недостаточная чувствительность и специфичность применяемых микроскопических и иммунологических методов диагностики, а также тенденция резкого увеличения численности популяции кровососущих клещей усугубляет эпизоотологическую обстановку.

В рамках настоящих исследований разработана ПЦР тест-система в режиме реального времени (qPCR) для идентификации Anaplasma marginale. Разработаны видоспецифичные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд TaqMan к высоко консервативному гену белка семейства теплового шока groEL. Результаты выравнивания последовательностей groEL гена в программном обеспечении BioEdit позволили выявить высококонсервативную область для A. marginale. Подобраны следующие праймеры и зонд: A. marg-U 5’-gatgagattgcacaggttgct-3’, A. marg-R 5’-tcctcaaccgttattaccccg-3’, An. marg-PF FAM-tgccaacttcccttacgcactgtgc-BHQ1. Оценка внутривидовой специфичности проводилась на 32 образцах A. marginale, 24 образцах A. centrale и 24 образцах A. ovis,  идентифицированных секвенированием по Cенгеру. При определении межвидовой специфичности в качестве положительного контроля использованы 3 образца A. marginale, 3 отрицательных контроля и 90 видов различных бактерий из коллекции лаборатории. Определение чувствительности реакции проводилось разведением плазмидной ДНК с исходной концентрацией 1,845 ng/µl, содержащей 4,96×10⁸ копий целевого гена. Для постановки qPCR на реакцию использовалось по 5 µl ДНК, предварительно разведенной сначала до 4,19 ×10⁶ копий на 1 µl для первого ряда лунок в 3 повторностях с последующими четырехкратными разведениями до 16 копий, а после двукратными разведениями до 1 копии. ПЦР тест-система показала высокую чувствительность, позволяющая обнаруживать ген groEL A. marginale в количестве 8 копий в реакции. Разработанная ПЦР тест-система в режиме реального времени для идентификации A. marginale обладает высокой специфичностью и позволяет дифференцировать от других видов Anaplasma spp. ПЦР в режиме реального времени для идентификации Anaplasma spp. ранее не применялась в Казахстане, ее преимуществом является скорость проведения анализа, исключение дополнительных стадий детекции, а также возможность определения статуса носителя инфицированного животного. qPCR требует меньше трудозатрат и значительно упрощает диагностику по сравнению с традиционными методами идентификации Anaplasma marginale, а одновременная детекция во время термоциклирования значительно ускоряет процесс по сравнению со стандартной PCR. Разработанная нами тест-система qPCR на основе гена groEL показала высокую чувствительность и специфичность, не уступающие аналогичным разработкам и может быть использована для эффективного мониторинга в эпизоотически неблагополучных регионах Казахстана. Выявление носителей инфекции позволит обеспечить контроль распространения A. marginale среди крупного рогатого скота и своевременное проведение профилактических мер.