КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЛИКОЗИДАЗ КАК ЭТАП СОЗДАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИНСТРУМЕНТОВ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ

Abstract

Антигены групп крови человека представляют собой олигосахаридные или белковые молекулы, располагающиеся на поверхности эритроцитов, эндотелия и большинства эпителиальных клеток. В практике трансфузиологии рутинным является тестирование на совместимость антигенов по системам ABO и RHD, которые являются важными для обеспечения безопасности пациента при переливании крови. На основе гликопротеиновых антигенов согласно системе ABO группы крови разделяют на 4 типа: A, B, AB, и O, в зависимости от типа присутствующего антигена.

Антигены A, B и H представляют собой углеводные структуры. Олигосахариды синтезируются поэтапно, причем присоединение каждого моносахарида катализируется специфической гликозилтрансферазой. Структурным различием между антигенами групп крови является наличие или отсутствие терминального остатка моносахарида, связанного с предшественником общей цепи в антигенах A, B и H соответственно. Бактериальные гликозидазы могут быть использованы при трансплантации органов для ферментативного отщепления – N-ацетилгалактозамина в случае антигена А и a-галактозы в случае антигена B, что приведет к превращению этих антигенов в универсальный непреобразованный H-антиген и, как следствие, к снижению вероятности острого отторжения трансплантата.

В задачу представленного исследования входило получение штаммов-продуцентов бактериальных рекомбинантных гликозидаз.

Аминокислотные последовательности a-D-галактозамин галактозидазы и N-ацетил-a-D-галактозамин деацетилазы Flavonifractor plautii взяты из базы данных UniProt – коды доступа P0DTR5 и P0DTR4 соответственно. Для оптимизации экспрессии генов в клетках E. coli путем обратной трансляции определяли нуклеотидные последовательности с заменой редких синонимических кодонов.

Последовательности генов бактериальных гликозидаз, синтезированные в виде двухцепочечных фрагментов ДНК (gBlocks), амплифицировали с использованием праймеров, несущих сайты узнавания для рестриктаз. После рестрикции ампликонов и вектора pET-24b(+) в ходе реакции лигирования получены гибридные конструкции, которыми трансформировали компетентные клетки E. coli XL-1 Blue. Наличие вставки в рекомбинантных плазмидах, выделенных из положительных клонов, подтверждено с помощью ПЦР и рестрикционного анализа. Бактерии штамма E. coli XJa(DE3) трансформировали сконструированными плазмидами для экспрессии a-D-галактозамин галактозидазы и N-ацетил-a-D-галактозамин деацетилазы обозначеными pET-24b-aGal и pET-24b-NADA соответственно.

Индукцию экспрессии проводили при 37°С в присутствии ИПТГ в конечной концентрации 0,5 мМ в течение 4 часов. Образцы клеточных лизатов индуцированных и неиндуцированных культур клеток затем анализировали в ходе ДСН-ПААГ электрофореза, по результатам которого показано накопление дополнительных белков в индуцированных клетках бактерий, соответствующих по молекулярной массе a-D-галактозамин галактозидазе (около 116 кДа) и N-ацетил-a-D-галактозамин деацетилазе (около 82 кДа) и обладающих гликозидазной активностью.