ПРОТЕОМНЫЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ХРОМАТИНА

Main Article Content

Authors

П.В. Тарлыков

Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева, г. Астана, Казахстан
Национальный центр биотехнологии, г. Астана, Казахстан

А.Т. Шоаиб

CNRS UMR 8126, Institut de Cancerologie Gustave Roussy, Villejuif, France

А.Т. Кулыясов

Национальный центр биотехнологии, г. Астана, Казахстан

Е.М. Раманкулов

Национальный центр биотехнологии, г. Астана, Казахстан
Назарбаев Университет, г. Астана, Казахстан

 

В.В. Огрызько

CNRS UMR 8126, Institut de Cancerologie Gustave Roussy, Villejuif, France

Abstract

Эпигенетика на сегодняшний день стала одной из самых быстроразвивающихся областей биологии, где особое внимание уделяется изучению хроматина. При этом одним из основных способов исследования хроматина является его иммунопреципитация. Данная техника широко используется уже более десяти лет для изучения ассоциации участков ДНК с регуляторными белками in vivo. В сочетании с другими высокопроизводительными методами, иммунопреципитация хроматина дополняет изучение экспрессионных профилей генов и позволяет проводить реконструкцию и анализ регуляторных механизмов.

Настоящая работа предлагает новую методику иммунопреципитации хроматина, заключающуюся в проксимальном биотинилировании белков, находящихся в непосредственной пространственной близости друг от друга, с последующей нативной иммунопреципитацией хроматина. Данная методика позволяет изучать белковый состав хроматина, находящегося в непосредственной близости от любого ядерного белка. Метод основан на коэкспрессии интересующего нас белка, «сшитого» с бактериальной биотин-лигазой, и гибридного гистона, содержащего биотин-акцептор (пептид, который специфично биотинилируется гибридной биотин-лигазой в непосредственной близости от интересующего белка).

Преимуществом данного метода является возможность использования альтернативных вариантов гистонов в виде гибридных белков вместо их коровых аналогов. Важно отметить, что их наличие коррелирует с особым функциональным состоянием хроматина. Кроме того, введение ковалентной метки в интересующий белок позволяет отслеживать временное состояние пост-трансляционных модификаций гистонов в любое нужное время после взаимодействия с гибридом, несущим биотин-лигазу. Таким образом, этот подход добавляет временное измерение к результатам анализа пост-трансляционных модификаций гистонов, находящихся в непосредственной близости от любого интересующего ядерного белка.

Keywords

хроматин, эпигенетика, биотинилирование, вестерн-блотинг, масс-спектрометрия

Article Details

References

Orlando V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation // Trends Biochem Sci. – 2000. – Vol. 25. - P. 99-104.

Ren B., Dynlacht B.D. Use of chromatin immunoprecipitation assays in genome-wide location analysis of mammalian transcription factors // Methods Enzymol. - 2004. – Vol. 376. – P. 304-315.

Weinmann A.S., Farnham P.J: Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation // Methods. – 2002. - Vol. 26. - P. 37-47.

Buck M.J., Lieb J.D: ChIP-chip: considerations for the design, analysis, and application of genome-wide chromatin immunoprecipitation experiments // Genomics. – 2004. - Vol. 83. – P.349-360.

Negre N., Lavrov S., Hennetin J., Bellis M., Cavalli G: Mapping the distribution of chromatin proteins by ChIP on chip // Methods Enzymol. – 2006. - Vol. 410. – P. 316-341.

Park P.J: ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology // Nat Rev Genet. – 2009. - Vol. 10. – P. 669-680.

Robertson G., Hirst M., Bainbridge M., Bilenky M., Zhao Y., Zeng T., Euskirchen G., Bernier B., Varhol R., Delaney A., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing // Nat Methods. – 2007. - Vol. 4. – P. 651-657.

O'Neill L.P., Turner B.M. Immunoprecipitation of native chromatin: NchIP // Methods. – 2003. - Vol. 31. – P. 76-82.

Ooi S.L., Henikoff J.G., Henikoff S. A native chromatin purification system for epigenomic profiling in Caenorhabditis elegans // Nucleic Acids Res. – 2010. - Vol. 38. - e26.

Chadwick B.P., Willard H.F. Histone H2A variants and the inactive X chromosome: identification of a second macroH2A variant // Hum Mol Genet. – 2001. - Vol. 10. – P. 1101-1113.

Chadwick B.P., Willard H.F: A novel chromatin protein, distantly related to histone H2A, is largely excluded from the inactive X chromosome // J Cell Biol. – 2001. - Vol. 152. – P. 375-384.

Costanzi C., Pehrson J.R. Histone macroH2A1 is concentrated in the inactive X chromosome of female mammals // Nature. – 1998. - Vol. 393. – P. 599-601.

Kulyyassov A., Shoaib M., Pichugin A., Kannouche P., Ramanculov E., Lipinski M., Ogryzko V. PUB-MS – a mass-spectrometry–based method to monitor protein-protein proximity in vivo // Journal of Proteome Research. – 2011. - Vol. 10. – P. 4416–4427.

Fernandez-Suarez M., Chen T.S., Ting A.Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation // J Am Chem Soc. – 2008. - Vol. 130. – P. 9251-9253.

Ong S.E., Blagoev B., Kratchmarova I., Kristensen D.B., Steen H., Pandey A, Mann M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics // Mol Cell Proteomics. – 2002. - Vol. 1. - P. 376-386.

Garcia B.A., Mollah S., Ueberheide B.M., Busby S.A., Muratore T.L., Shabanowitz J., Hunt D.F. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry // Nat Protoc. – 2007. - Vol. 2. – P. 933-938.

Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels // Anal Chem. – 1996. - Vol. 68. – P. 850-858.

Huang J., Huen M.S., Kim H., Leung C.C., Glover J.N., Yu X., Chen J. RAD18 transmits DNA damage signalling to elicit homologous recombination repair // Nat Cell Biol. – 2009. - Vol. 11. – P. 592-603.

Watanabe K., Iwabuchi K., Sun J., Tsuji Y., Tani T., Tokunaga K., Date T., Hashimoto M., Yamaizumi M., Tateishi S. RAD18 promotes DNA double-strand break repair during G1 phase through chromatin retention of 53BP1 // Nucleic Acids Res. – 2009. - Vol. 37. – P. 2176-2193.