ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ СОИ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К АБИОТИЧЕСКИМ СТРЕССАМ
Main Article Content
Authors
О.И. Кершанская
РГП Институт биологии и биотехнологии растений КН МОН РК, г. Алматы
Abstract
Молекулярные механизмы контроля устойчивости растений к абиотическим стрессам базируются на активации и регуляции специфических генов, таких как C4-pepc, C4-ppdk из кукурузы (засуха), desA12licBM3 из Synechocystis sp. PCC 6803 (холод), FeSOD из Arabidopsis thaliana (окислительный стресс). Cоздана генетическая конструкция целевого гена ppdk и использован ген desA12licBM3.
Существующие методы генетической трансформации сои имеют ряд существенных недостатков: они генотип-зависимы, включают этапы культивирования клеток в культуре in vitro и регенерации растений, применяются только 1-2 генетические конструкции целевых и репортерных генов, позволяют получать слабые химерные растения с низкой эффективностью трансформации; процесс создания трансгенов составляет 320-380 дней. Разработанный нами способ germ-line генетической трансформации сои с использованием прорастающих пыльцевых трубок позволяет избежать получения химерных неоднородных растений, генотип независим, экономичен, быстр, близок к естественному половому размножению, относительно эффективен.
Используя 5 коммерческих сортов США и 25 казахстанских и зарубежных разновидностей сои, районированных в Казахстане, мы интродуцировали данные гены в сою, используя собственный разработанный и запатентованный способ germ-line пипетирования Agrobacterium, с последующим молекулярным подтверждением и изучением физиолого-биохимических особенностей устойчивости к стрессам полученных трансгенов.
Получено около 5000 семян трансгенных растений сои со вставкой в геном и экспрессией генов ppdk и desA12licBM3. Результаты ПЦР анализа трансгенных растений сои первого поколения Т1 подтвердили наличие бендов, соответствующих молекулярной массе 645 нп (ген ppdk) и 692 нп (ген desA12licBM3) с эффективностью трансформации 1,73 и 1,89% от числа изначально скринированных семян. Подтверждена стабильная трансформация сои во втором поколении, Т2. Высокий уровень экспрессии данных генов в трансгенной сое подтвержден повышением урожая до 148%, увеличением содержания воды в листьях на 7-13%, содержания пролина в листьях на 11-39%, активизацией фермента супероксид дисмутазы на 85-110% в условиях засухи и на 40-200% в условиях низких положительных температур. Радикальное улучшение сельскохозяйственных культур, такое как генетическая инженерия устойчивости растений к абиотическим стрессам, необходимо для обеспечения продовольственной безопасности.
Keywords
гены ppdk и desA12licBM3, метод генетической germ-line трансформации, абиотические стрессы, соя
Article Details
References
McCabe D.E., Swain W.F., Martinelli B.J., Christou P. Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration // Biotechnology. - 1988. – Vol. 6. - Р. 923–926.
Martinell B.J., Julson L.S., Emler C.A., Yong H., McCabe D.E., Williams E.J. Soybean Agrobacterium transformation method, 2002. U.S. Patent №6384301.
Yan B., Srinivasa Reddy M.S., Collins G.B., Dinkins R.D. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill.] using immature zygotic cotyledon explants // Plant Cell Report, 2000. – Vol. 19. - Р. 1090–1097.
Zhang Z., Xing A., Staswick P., Clemente T. The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean // Plant Cell Tissue Organ Cult., 1999. – Vol. 56. - Р. 37–46.
Paz M.M., Martinez J.C., Kalvig A.B., Fonger T.M., Wang K. Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium mediated soybean genetic transformation // Plant Cell Report. - 2005. - P. 206-213.
Wang A., Fan H., Singsit C., Ozias-Akins P. Transformation of peanut with a soybean vspB promoter-uidA chimeric gene: I. Optimization of a transformation system and analysis of GUS expression in primary transgenic tissues and plants // Physiol. Plant. -1998. – Vol. 102. - Р. 38–48.
Shou Н., Palmer R.G. and Wang K. Irreproducibility of the soybean pollen-tube pathway transformation procedure, 2011. Web site.
Zhou G., Weng J., Gong Z., Yang W., Shen W., Wang Z., Tao Q., Huang J., Qian S., Liu G., Ying M., Xue D., Hong A., Xu Y., Chen B., Duan X. Molecular breeding of agriculture: a technique for introducing exogenous DNA into plants after self-pollination // Scientia Agricultura Sinica, 1988. – Vol. 21. - Р. 1-6.
Hui L., Tian-long W. Transfoming agrobacterium into soybean by means of pollen tube pathway induced by CaCl2. Agriculture & Biology College, Shanghai Jiaotong University. Shanghai, 2011. Web site.
Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A. Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method. Planta. - 2003. - P. 35-43.
Trick H.N., Dinkins R.D., Santarem E.R., Di R., Samoylov V., Meurer C., Walker D., Parrott W.A., Finer J.J., Collins G.B. Recent advances in soybean transformation // Plant Tissue Cult. Biotechnol. - 1997. - Vol. 3. - P. 9–26.
Liu J., Su Q., An L. and Yang A. Transfer of a minimal linear marker-free and vector-free smGFP cassette into soybean via ovary-drip transformation // Biotechnol. Lett. - 2009. – Vol. 31(2). - P. 295-303.
Martinell B.J., Julson L.S., Emler C.A., Huang Y., McСabe D.E., Williams E.J. Soybean transformation method, 2009. Patent USA №20090077694.
Li Z., Nelson R.L., Widholm J.M., Bent A. Soybean transformation via the pollen tube pathway. Soybean Genet Newslett., 2002. - Vol. 29. - P. 1–11.
Li Z., Nelson R., Widholm J., Bent A. Soybean transformation via the pollen tube pathway. University of Illinois, Urbana.et al., 2009. Web site.
McWilliams D.A., Berglund D.R., Endres G.J. Soybean Growth and Management. Quick Guide: North Dakota State University and University of Minnesota, 2004. Web site.
Голденкова-Павлова И.В., Мирахорли Н., Мали А.Р., Исаенко Е., Картель Н.А., Лурьева Н.О., Абдеева И.А. Экспериментальные методы для создания трансгенных растений, устойчивых к стрессовым факторам // Цитология и генетика. - 2007. - Т. 41, №3. - С. 44-49.
Wang W., Vinocur B., Altman A. Plant response to drought, salinity and extreme temperature: towards genetic engineering for stress tolerance. Planta. - 2003. - Vol. 218. - P. 1-14.
Bates L.S., Waldern R.P., Teare I.D. Rapid determination of free proline for water stress studies // Plant Biol. - 1973. - P. 205-207.
“SOD assay Kit” (Sigma) для определения активности супероксид дисмутазы, 2011. Web site: Superoxide Dismutase Kit - BioVision.com
Giannopolitis C.N., Ries S.K. Superoxide dismutases occurrence in higher plants // Plant Physiol. - 1977. – Vol. 59. - Р. 309-314.
Kershanskaya O.I., Teixeira da Silva J.A. Photosynthetic Basis for Wheat Crop Improvement: Genetic Modification of Photosynthesis. Global science book, AAJPSB, 2010. – №4 (SI 1). – P. 27-34.
Кершанская О.И., Дидоренко С.В., Есенбаева Г.Л. Способ germ-line генетической трансформации сои. Инновационный патент РК, 2012. - №25950.
Кершанская О.И. Генетическая инженерия растений. Практический подход. - Алматы, 2007. – 152 с.