ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ И ОПТИМИЗАЦИИ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM - Кислицин, В. Ю.; Чулкин, А.М.; Рожкова, А. М. (Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2024)
Мицелиальный гриб P. verruculosum является сапрофитным грибом-целлюлолитиком. Ранее с помощью многостадийного неупорядоченного мутагенеза был получен промышленный штамм-продуцент целлюлазных препаратов B1-221-151, обладающий продуктивностью до 60 г секретируемого белка на литр культуральной жидкости. Основными ферментами его секретирумого комплекса являются целлобиогидролаза 1 и 2 (до 50%), эндоглюканазы (до 12%), β-глюкозидаза (до 4%), и ксиланазы. Также ранее из штамма B1-221-151, был получен рецепиентный штамм В1-537 с дефектом гена нитратредуктазы (niaD), что позволяет использовать его для получения препаратов гетерологичных ферментов. Получаемые таким образом ферментные препараты находят применение в сельском хозяйстве, текстильном производстве, биоконвесии растительных отходов и целлюлозо-бумажной промышленности. Развитие метода геномного редактирования системой CRISPR/Cas дало мощный инструмент для дальнейшего изучения и оптимизации мицелиальных грибов для промышленных задач. Нами также была адаптирована методика геномного редактирования для мицелиального гриба P. verruculosum, позволяющая получать штаммы с нокаутами маркерного гена niaD и целевых генов. С помощью адаптированной методики нами было изучено влияние транскрипционных факторов Clr1, Clr2, XlnR, TacA и внутриклеточной β –глюкозидазы, Bgl2, на экспрессию целлюлаз в грибе P. verruculosum. Наиболее интересный эффект наблюдался при нокауте гена транскрипционного фактора TacA. Его нокаут привёл к увеличению целлобиогидролазной активности более чем в 4 раза, β-глюкозидазной активности в 2 раза, эндоглюканазной в 1,5 раза и ксиланазной более чем в 2 раза по сравнению со штаммом B1-221-151. Также новый штамм P. verruculosum может легко использоваться для экспрессии генов гетерологичных ферментов. Например, был получен штамм P. verruculosum dT16-13, экспрессирующий помимо собственных целлюлаз β-глюкозидазу Aspergillus niger. Гидролитическая активность ферментного препарата получаемого с помощью нового штамма значительно превосходит по гидролитической активности по целлюлозосодержащим материалам ферментный препарат продуцируемый штаммом B1-221-151. При этом выход глюкозы и восстанавливающих сахаров и глюкозы при гидролизе микрокристаллической целлюлозы достигает 60%, а при гидролизе измельчённой осины 40% и 58% соответственно, от изначальной массы субстрата за 48 часов. Таким образом, адаптация метода геномного редактирования для мицелиального гриба P. verruculosum позволило решить как ряд фундаментальных задач, так и создать новый высокоэффективный реципиентный штамм.