ДЕТОКСИЦИРУЮЩИЕ АФЛАТОКСИН В1 И ЗЕАРАЛЕНОН РЕКОМБИНАНТНЫЕ ФЕРМЕНТЫ КАК ИННОВАЦИОННЫЕ СРЕДСТВА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕКОНТАМИНАЦИИ ЗЕРНОВЫХ КОРМОВ - Щербакова, Л.А.; Синельников, И.Г.; Зоров, И.Н. (Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2024)
Удовлетворяющие современным требованиям качество и безопасность продукции растениеводства имеют первостепенное значение для востребованности ее на мировом и национальном рынках. Однако, контаминация этой продукции, в том числе фуражного зерна, опасными для теплокровных микотоксинами, в частности афлатоксином B1 (АФВ1) и зеараленоном (ЗЕА) критически снижает конкурентоспособность зерновых кормов. В связи с широким распространением в природе видов Aspergillus и Fusarium, продуцирующих, соответственно, АФВ1 и ЗЕА, и способностью этих грибов развиваться на кормах во время хранения проблема микотоксинового загрязнения имеет глобальной характер. Применение существующих способов деконтаминации зерновых кормов часто ограничено либо из-за их недостаточной эффективности или негативного воздействия на обрабатываемую продукцию, либо в связи с высокими энергозатратами и стоимостью обработок. Создание деконтаминационных препаратов на основе рекомбинантных токсин-деградирующих ферментов, полученных с помощью их гетерологичной экспрессии в легко культивируемых и высокопроизводительных микробных продуцентах – инновационнонный подход, позволяющий обеспечить кормовую безопасность фуражного зерна, одновременно сохраняя его питательную ценность. Данный подход был использован нами для получения рекомбинантных АФВ1-оксидазы (rAFO) опенка дубового (Armillaria tabescens) в клетках дрожжей Pichia pastoris (штамм GS115) и ЗЕА-гидролазы (rZHD) из аскомицета Clonostachys rosea в культуре штамма PCA-10 гриба Penicillium canescens. Для интродукции генов, кодирующих АФВ1-оксидазы (afo) и ЗЕА-гидролазы (zhd101) в геномы соответствующих реципиентных штаммов были сконструированы плазмидные векторы pPIGA-afo и pXEG-ZHD, содержавшие промоторную последовательность гена алкогольоксидазы AOXI (в случае pPIGA-afo) или ксиланазы xylA (в случае pXEG-ZHD). После подтверждения корректности вставок adtz и zhd101 (ПЦР и секвенирование по Сенгеру) и последующей идентификации rAFO и rZHD в секретоме трансформированных штаммов методами ДСН-ПААГ ЭФ и MALDI-TOF МС, рекомбинантные ферменты были выделены из культуральной жидкости наиболее продуктивных клонов и очищены до гомогенного состояния с помощью металло-хелатной хроматографии. Полученные ферментные препараты были использованы для обработки образцов зерна пшеницы и кукурузы, инокулированого токсигенными А.flavus или F. culmorum. Во всех экспериментах обработка зараженных образцов препаратами рекомбинантных ферментов при оптимальных для их целевой активности 30°С и значениях рН (6,0 для rAFO и 8,5 для rZHD) приводила к достоверному снижению загрязненности зерна микотоксинами. Так, ВЭЖХ-анализы экстрактов контаминированного зерна показали, что через 72 часа после его обработки rAFO содержание АФВ1 в образцах не превышало допустимых для фуражного зерна норм, установленных правилами безопасности Таможенного Союза, а обработка зерна препаратом rZHD приводила к его полной очистке от ЗЕА уже через 48 часов. Эти данные свидетельствуют о перспективности разработки средств деконтаминации кормов на основе рекомбинантных ферментов. Исследования поддержаны Российским научным фондом (проект РНФ №22-16-00153).