РАЗРАБОТКА ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМЫ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ FRANCISELLA TULARENSIS - Даулетов, А.Е.; Турсунбай, Н.Е.; Кайыржанова, А.Д.; Избанова, У.А.; Шевцов, А.Б. (Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2024)
Туляремия – зоонозное заболевание, вызываемое грамотрицательной бактерией Francisella tularensis, факультативный внутриклеточный патоген. Десяти бактериальных клеток F. tularensis subsp. tularensis достаточно для развития инфекционного процесса с летальностью (без лечения) до 24%, что делает F. tularensis потенциальным биологическим оружием. Эпидемиологический мониторинг играет важную роль в контроле за туляремией в Казахстане. Большое разнообразие восприимчивых животных, наличие переносчиков и природных резервуаров выводят на первый план методы основанные на прямом выявлении возбудителя. Данный фактор повышает значимость разработки и использования ПЦР тест-систем при эпидемиологическом мониторинге, особенно, при работе со сложными образцами из окружающей среды. ПЦР в реальном времени является более быстрым, чувствительным и специфическим методом обнаружения патогенов. В рамках настоящих исследований разработана ПЦР тест-система в режиме реального времени (qPCR) для идентификации F. tularensis. Разработаны видоспецифичные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд TaqMan к последовательности многокопийного инсерционного элемента ISFtu1, частота встречаемости которого в геноме F. tularensis достигает 50 копий. Результаты выравнивание последовательностей ISFtu1 12 штаммов F. tularensis и 1 штамма F. novacida показало, что эта область высоко консервативна в анализируемых геномах. Был выбран оптимальный участок для подбора прямого праймера ISFtu1_F_54, обратного праймера isftu-1_R_189 и флуоресцентного зонда isftu-2_Probes_108. Оценка специфичности была подтверждена на ДНК двух подвидов F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. holarctica, 27 не целевых бактериальных видах и 3 эукариотических организмов. Наблюдался специфический сигнал только на образцах целевых организмов, без появления амплификации на не целевых образцах. Проверка чувствительности проводилось 4-х кратном серийном разведений ДНК F. tularensis subsp. mediasiatica позволила установить минимальный порог чувствительности в 15 геномных эквивалентов в реакции. В диапазоне от 1 млн до 15 геномных копий в реакции отчетливо наблюдается регистрация флуоресцентного сигнала с пороговым циклом от 15 до 35 соответственно. Использование более низкой копийности не приводит к накоплению флуоресцентного сигнала. По своей чувствительности разработанная нами qPCR не уступает аналогам опубликованным в литературных источниках и потенциально может быть использован для тестирования ДНК выделенной от естественных резервуаров, переносчиков и объектов внешней среды.