ПРАКТИЧЕСКИЙ ОПЫТ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ХЛОРОПЛАСТНЫХ ГЕНОМОВ КОРОТКИМИ РИДАМИ - Шевцов, А.Б.; Ержанова, Н.С.; Амиргазин, А.О.; Тұрсұнбай , Н.Е. (Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2024)
Хлоропласты (пластиды) представляют собой растительные органеллы с автономной кольцевой молекулой ДНК размером от 72 до 217 тысяч пар нуклеотидов, кодирующей около 130 генов вовлеченных в фотосинтез. Хотя геномы хлоропластов содержат высококонсервативные гены, необходимые для роста и развития растений, они также содержат вариабельные области, т.е. межгенные области и структурные вариации внутри генов, что отражает важную эволюционную информацию растений. Полные последовательности генома хлоропластов могут быть использованы для эволюционных исследований внутри и между различными группами растений. Для полногеномного секвенирования хлоропластных геномов (хпДНК) применяется две стратегии: амплификация всего генома хлоропластов из тотальной ДНК с использованием длинной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и прямое выделение хпДНК из свежего растительного материала с последующим секвенированием с использованием высокопропускных секвенаторов. В последнем случае качество и чистота выделенной хлоропластной ДНК напрямую влияет на полученный результат. Предложен ряд методов для отделения хлоропластов и выделения ДНК. Некоторые методы, такие как центрифугирование хлоропластов в градиенте с сахарозой требуют наличия дорогостоящего оборудования, а методы основанные на применение ДНКаз не всегда эффективны. На наш взгляд, осаждение хлоропластов в растворах с повышенной ионной силой позволяет получить достаточно очищенные препараты хлоропластной ДНК пригодные для секвенирвоания на NGS платформах. Детальный протокол описан в работе Shi C. с соавторами (2012). За период 2023 года сотрудниками Национального центра биотехнологии было проведено выделение хпДНК из листьев 71 одного вида растений. Концентрация ДНК в 1 мкл раствора варьировала от 2,4 до 32,1 нг, что достаточно для секвенирвоания на MiSeq (Illumina). Секвенирование 14 образцов позволило получить от 1,2 до 2 млн. ридов на образец. Картирование ридов на собранный хлоропластный геном показывает целевое секвенирвоание на уровне 50-86%. Применяемая технология может быть использована для изучения и подтверждения таксономического статуса высших сосудистых растений Казахстана.