4/2016

 

Manat Е., Sarina N.I., Eskendirova S.Z., Shustov A.V., Mukanov К.К.
National center for biotechnology
13/1, Sh. Valikhanovst., Astana, 010000, Kazakhstan
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ABSTRACT

Despite the significant progress jointly made by scientists and practical veterinary service in the Republic of Kazakhstan, the problem of animal brucellosis has not been completely solved. Consistently high levels of human brucellosis morbidity, which is due to extremely tense epizootic situation and large socio-economic damage, determine the special importance of this infection in the structure of infectious pathologies. One of the potential to increase the sensitivity and specificity of serological diagnostic methods of brucellosis is the use of recombinant analogs of immunodominant proteins of pathogenic Brucella, which diversity has determined and studied at the present time. Periplasmic protein BP26 is a specific antigen which is highly conserved for genus of Brucella. It has high diagnostic value for use in the development of immunoassays and immunochromatographic test kits of brucellosis for the veterinary and medical use.

A highly sensitive and specific immunoassay system for rapid detection of antibrucellar antibodies was developed on the basis of recombinant Brucella antigen BP2. It is intended for serological diagnosis of brucellosis in animals. High diagnostic efficiency of ICA was tested in 962 samples of blood serum of cattle and goats, sheep as well as 16 control reference sera.

Keywords: immunochromatographic assays, recombinant antigen, blood serum, antibody.

 

УДК 619:616.98

 

ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА

 

 

АБСТРАКТ

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в Республике Казахстан совместными усилиями научного потенциала и практической ветеринарной службы, проблема ликвидации бруцеллеза животных окончательно не решена. Стабильно высокий уровень заболеваемости бруцеллезом людей, обусловленный крайне напряженной эпизоотической ситуацией, и большой социально-экономический ущерб определяют особую значимость этой инфекции в общей структуре инфекционных патологий. Одним из потенциалов повышения чувствительности и специфичности серологических методов диагностики бруцеллеза является использование рекомбинантных аналогов иммунодоминантных белков патогенных бруцелл, спектр которых окончательно определен и изучен в настоящее время. Периплазматический белок ВР26 является специфическим антигеном, высококонсервативным для всего рода Brucella, и обладает большой диагностической ценностью для использования в разработке иммуноферментных и иммунохроматографических тест-систем на бруцеллёз как ветеринарного, так и медицинского применения.

На основе рекомбинантного антигена бруцелл ВР26 разработана высокочувствительная и специфичная иммунохроматографическая тест-система для экспресс-обнаружения противобруцеллезных антител, предназначенная для серологической диагностики бруцеллеза животных. Высокая диагностическая эффективность ИХА определена на 962 испытуемых образцах сывороток крови крупного и мелкого рогатого скота, а также 16 контрольных референс-сыворотках крови.

Ключевые слова: иммунохроматографическая тест-система, рекомбинантный антиген, сыворотка крови, антитела.


ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в Республике Казахстан совместными усилиями научного потенциала и практической ветеринарной службы, проблема ликвидации бруцеллеза животных окончательно не решена. Стабильно высокий уровень заболеваемости бруцеллезом людей, обусловленный крайне напряженной эпизоотической ситуацией, и большой социально-экономический ущерб определяют особую значимость этой инфекции в общей структуре инфекционных патологий. В связи с этим крайне востребованы методы, обеспечивающие эффективную серологическую диагностику этого заболевания сельскохозяйственных животных .Общепринятые серологические реакции – РА, РСК и РБП, используемые в диагностике бруцеллеза, отличаются между собой по аналитической чувствительности к определенным классам иммуноглобулинов и, поэтому, каждая из них в отдельности характеризуется относительно низкой объективностью, чем при комплексном применении.

Комплексные диагностические исследования на бруцеллез способны провести только специализированные ветеринарные лаборатории, что создает дополнительные трудности при проведении профилактических и карантинных мероприятий. Кроме того, препараты как интактных клеток бруцелл, так и их полисахаридные антигены, содержат на своей поверхности антигенные детерминанты, общие для бруцелл и других близкородственных грамотрицательных микроорганизмов – Yersiniaenterocolitica 09, Escherichiacoli, Vibriocholerae, Salmonella группы N и др., что приводит к получению ложноположительных результатов и может быть причиной необоснованного убоя животных [1-7].

Хотя современные инструментальные методы выявления постинфекционных антител в сыворотке крови – иммуноферментный анализ (ИФА)– характеризуются высокой степенью точности, они трудоемки, сложны, занимают много времени, требуют высококвалифицированного персонала и дорогостоящего оборудования, что ограничивает их применение в технически оснащенных ветеринарных лабораториях. Поэтому растет потребность в методически простых и доступных для широкого круга пользователей экспресс-методахиммуноанализа, позволяющих проводить определение в малооборудованных лабораториях, в полевых и домашних условиях и не уступающих по аналитическим характеристикам. Многим из перечисленных условий удовлетворяет иммунохроматографический анализ, что делает его одним из наиболее перспективных среди других современных иммунодиагностических тестов. Чувствительность определения с помощью иммунохроматографическихтест-полосок не уступает чувствительности иммуноферментного анализа или вестерн-блота, при этом, в отличие от последних, иммунохроматография не требует длительных инкубаций или промывок и не нуждается в дополнительном оборудовании. Эти тест-системы нашли широкое применение в медицинской практике (определение наркотических средств, ранняя диагностика беременности, скрининг особо опасных инфекций и урогенитальных заболеваний), в сельскохозяйственном мониторинге.

Одним из потенциалов повышения чувствительности и специфичности серологических методов диагностики бруцеллеза является использование рекомбинантных аналогов иммунодоминантных белков патогенных бруцелл, спектр которых окончательно определен и изучен в настоящее время. На современном этапе технология получения рекомбинантных белков является основой в разработке и создании диагностических препаратов нового поколения при ряде многих инфекционных заболеваний. Технология, основанная на использовании генетически трансформированного штамма-продуцента, в отличие от традиционных технологий, позволяет получать высокоочищенные стабильные препараты рекомбинантных антигенов возбудителя болезни. Характерной особенностью микроорганизмов рода Brucella является высокая гомологичность их ДНК и отсутствие гомологии с представителями других родов микроорганизмов. При этом изменчивость бруцелл (диссоциация, трансформация и т.п.) не ведет к заметной дивергенции их генома. Следовательно, использование белковых антигенов не только дополняет общепринятую систему тестов идентификации бруцелл, но и во многих случаях является единственным достоверным показателем принадлежности штаммов к роду Brucella[5-10].

Белки внешней мембраны (OutermembraneproteinsOMP)бруцелл широко рассматриваются зарубежными исследователями как более специфичные компоненты в создании новых вакцинных и диагностических препаратов. Предполагается, что именно белки внешней мембраны определяют вирулентность и специфичность бруцелл. Белки внешней мембраны (OMP) бруцелл были идентифицированы в 80-е годы прошлого столетия различными группами исследователей. Впервые J.E. Mayfieldetal. (1988) изолировали и клонировали ген, кодирующий белковый антиген Brucellaabortus с молекулярной массой 31 кДа(OMP31) и экспрессировали его в геном кишечной палочки. Нуклеотидная последовательность гена OMP31 была использована для разработки ПЦР-анализа. Исследователями была определена эффективность рекомбинантного аналога ОМР31для обнаружения противобруцеллезных антител методом ИФА [11-13]. T.A. Fichtetal. (1988; 1989) клонировали гены Omp 2L и Omp 2aBrucellaabortus, ответственные за синтез пориновых белков с молекулярной массой 36 и 33 кДа [14]. Успешно осуществлены другими исследователями клонирование и экспрессия в гетерологичной системе периплазматического белкабруцеллCu-Zn-SOD [15-17], рибосомального белка L7/L12 [18,19] и цитоплазматических белков теплового шока –GroEL и HspGroES[3,7,10], относящихся к категории иммуногенных белков бруцелли обладающих выраженными протективными свойствами.

Периплазматический белок ВР26 был выбран нами в качестве потенциального антигена для использования в диагностической тест-системе по нескольким причинам. Во-первых, согласно последним данным научной литературы, он вырабатывается бруцелламина всех стадиях развития инфекции и является одним из наиболее узнаваемых иммунной системой как человека, так и животных специфических антигенов бруцелл. Этот белок является иммунологически доминантным антигеном бруцелл, и антитела к нему формируются практически у всех зараженных бруцеллезом животных. Иммуноферментные тест-системы на основе рекомбинантного антигена позволили диагностировать бруцеллез в 95,4-96,7% случаев. Кроме того, антитела к ВР26, обнаруживаемые в сыворотках больных бруцеллезом на всех стадиях течения заболевания, обладают высокой специфичностью и не имеют кросс-реактивности с антигенами других близкородственных микроорганизмов [20-26]. Во-вторых, ВР26– самый небольшой из известных белков внешней мембраны бруцелл, и его небольшой размер повышает вероятность успешной гетерологичной экспрессии в лабораторных штаммах Е. coli. Первичная структураантигенаВР26 аннотирована в базе данных NCBI (GenBank) и, согласно данным литературы, чрезвычайно консервативна для всех видов и штаммов бруцелл[27-30]. Белок ВР26 выполняет функцию трансмембранного рецептора, локализованного в периплазматическом пространстве клеточной стенки бруцелл. Сравнительно недавно исследователями представлена информация о конформационной структуре и моделировании пространственной организации белка ВР26[31]. В третьих, большинство последних зарубежных исследований по совершенствованию серологической диагностики бруцеллеза основаны на использовании рекомбинантного антигена ВР26. Анализ нуклеотидной последовательности ВР26 как патогенных,так и вакцинных штаммов и видов бруцелл показал их полную идентичность. ВР26 является высококонсервативным белком для штаммов бруцелл из различных географических регионов мира, что доказано исследованиями референтных сывороток методом иммуноблотинга[25-30].

Поскольку ВР26 является специфическим антигеном, высококонсервативным для всего рода Brucella, данный антиген обладает большой диагностической ценностью для использования в разработке иммуноферментных и иммунохроматографических тест-систем на бруцеллёз как ветеринарного, так и медицинского применения.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования являются рекомбинантный антигенВР26, исследуемые сыворотки крови крупного и мелкого рогатого скота, конъюгатыиммуноглобулинсвязывающего белка – протеинаGс коллоидным золотом.

В работе применяли козьи поликлональныеантитела против IgG крупного рогатого скота («Sigma», США), рекомбинантный протеинG(«Sigma», США),золотохлористоводородную кислоту, Твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА), цитрат натрия, Na2CO3, NaHCO3, (NH4)2SO4, NaCl. Все соли были аналитической или химической чистоты.

Растворы для получения КЗ и его конъюгатов готовили на воде, деионизированной с помощью установки MilliQ («Millipore», США).

Рекомбинантный антиген ВР26очищался на колонке HisTrap («Amersham», США) c использованием хроматографической системы AktaFPLC («Amersham», США).

 

Определение аналитической чувствительности рекомбинантного антигена ВР26с помощью непрямого твердофазного ИФА

Рекомбинантный антиген возбудителя бруцеллеза ВР26 сорбировали в лунках микропланшета в течение ночи при 4°Сиз 100 мкл раствора с концентрацией от 10 мкг/мл до 1 мкг/млв 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,1М NaCl (ФСБ). Микропланшет четырехкратно промывали ФСБ с 0,05% Tween 20 (ФСБТ), после чего в лунки вносили по 100 мкл позитивных и негативных контрольных сывороток в разведении 1:100 и инкубировали 1 ч при 37°С. Затем микропланшет повторно промывали, добавляли 100 мклантивидовогоиммунопероксидазногоконъюгата (разведение 1:5000 в ФСБТ) и инкубировали 1 ч при 37°С. После промывания определяли каталитическую активность связавшейся с носителем метки. Для этого использовали субстрат пероксидазы– 3,3',5,5'тетраметилбензидин (0,4 мМ) в 40 мМ натрий цитратном буфере, рН 4,0, с 3 мМ Н2О2. В лунки микропланшета вносили по 100 мкл субстрата, инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре, останавливали реакцию добавлением 50 мкл 1М H2SO4 и измеряли поглощение продуктов ферментативной реакции при длине волны 450 нм (А450).

 

Получение коллоидного золота цитратным методом по G. Frens (1973)[32]

К 97,5 мл деионизованной воды добавляли 1,0 мл 1%-ного раствора HAuCl4, доводили до кипения и при перемешивании добавляли 1,5 мл 1%-ного раствора цитрата натрия. Смесь кипятили еще 25 мин, затем охлаждали и хранили при 4-6°С.

 

Электронная микроскопия

Препараты коллоидного золота наносили на специальные сеточки (400 меш.Formvar/Carbon«TedPella, Inc,США). Снимки получали на электронном микроскопе CarlZeizz («LIBRA12», Германия). Фотографии получали в программе «JTEM» при увеличении 200000-25000.

 

Получение флокуляционной кривой

Определение оптимального количества иммуноглобулинсвязывающегобелкаG, иммобилизованного на коллоидных частицах золота (построение флокуляционной кривой), осуществляли на спектрофотометре MicroplateReaderModel 680 («Bio-Rad», США) при длине волны 580 нм.Готовили ряд разведений протеина Gс концентрациями в диапазоне от 880 до 0,44 мкг/мл. По 20 мкл этих растворов добавляли в лунки микропланшета к 200 мкл раствора коллоидного золота (OП520=1).После инкубации в течение 10 мин. при комнатной температуре в каждую лунку вносили по 20 мкл 10%-ного раствора NaCl, через 10 мин. измеряли OП580 и строили ее зависимость от концентрации антител. Определяли точку выхода полученной зависимости (флокуляционной кривой) на плато и выбирали для конъюгирования концентрацию АТ, на 10-15% превышающую эту величину.

 

Получение конъюгатовиммуноглобулинсвязывающих белков – белок А и белокG коллоидное золото поG.Hermanson(2008)[33]

Перед конъюгированием с частицами коллоидного золота протеинGдиализовали против 1000-кратного объема 10 мМ соответствующего буфера, рН 9,0 в течение 2 ч при 4°С. К коллоидному золоту (А520=1,0) добавляли 0,1М К2СО3 до достижения рН 9,5, после чего вносили в раствор протеинG в выбранной концентрации. Смесь инкубировали 45 мин при комнатной температуре и перемешивании, затем добавляли БСА до конечной концентрации 0,25%. Частицы коллоидного золота с иммобилизованным на них иммуноглобулинсвязывающим белкомG отделяли центрифугированием при 8000 g в течение 30 мин.После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в ФСБ, содержащем 0,05% БСА и 0,05% Tween 20 (ФСБТ). При необходимости длительного хранения к полученному продукту добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,02%.

 

Определение количества иммуноглобулинсвязывающего белка – протеинаG, иммобилизованного на коллоидных частицах

Препараты надосадочной жидкости, полученные после осаждения конъюгатов«протеинG– коллоидное золото» и растворыиммуноглобулинсвязывающего белкаGв известной концентрации (от 0,1 до 100 нг/мл) вносили в лунки микропланшета исорбировали в течение ночи при 4°Св 10 мМфосфатном буфере, рН 7,4, с 0,1М NaCl (ФСБ). Микропланшет четырехкратно промывали ФСБ и ФСБ с 0,05% Tween 20 (ФСБТ), после чего в лунки вносили по 100 мкл раствораантивидовогоиммунопероксидазногоконъюгата (разведение1:5000 в ФСБТ) и инкубировали 1 ч при 37°С.По оптической плотности продукта реакции связавшегося фермента строили градуировочную зависимость для свободныхиммуноглобулинсвязывающих белков, проводили расчет для препаратов надосадочной жидкости конъюгата«протеинG– коллоидное золото» и, исходя из полученных результатов, определяли количество белка, иммобилизованного на КЗ.

Спектрофотометрические измерения оптической плотности препаратов коллоидного золота и их конъюгатов проводили на спектрофотометре PD-303 UV«Apel», Япония.

Определение рН буферных растворов проводили на аппарате ProfessionalMeterPP-20 «Sartorius», Германия.

Концентрацию белка в препаратах определяли по M. Bradford (1976)[34].

 

Изготовление иммунохроматографическихтест-полосок

В комплектацию иммунохроматографическихтест-полосок входили мембраны mdiEasypack («AdvancedMicrodevices», Индия). На автоматическом диспенсере BioDot («ImageneTechnology», США) на подложку наносили конъюгат «протеинG – коллоидное золото» в разведении, соответствующем А520=2,0 (32 мкл на 1 см полосы). Для формирования аналитической зоны использовали рекомбинантный антиген ВР26, контрольной зоны – IgG из антисывороток против IgG крупного рогатого скота. В обоих случаях на 1 см полосы наносили 2 мкл раствора с концентрацией 0,5 мг/мл в ФСБ с 10% глицерина. Собранный мультимембранный композит разрезали на автоматическом нарезчике IndexCutter/1 («A/PointTechnologies»,США) на полоски размером 78×3,5 мм. Нарезку и высушивание иммунохроматографических тест-полосок проводили при 20-22°С в специальном помещении с относительной влажностью воздуха не более 30%.

 

Иммунохроматографический анализ

Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Тест-полоску в вертикальном положении погружали в анализируемую пробу на 1,5 мин., затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Результат контролировали через 10 мин. после начала анализа визуально в условных единицах.

Результаты серологических исследований подвергались статистической обработке [35].

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Первоначально по стандартной методике нами был получен золь коллоидного золота (КЗ), средний диаметр частиц которого составил 27±5 нм. Размер частиц 25-30 нм оптимален для сорбции белка и последующей миграции полученного комплекса через поры мембран иммунохроматографическойтест-полоски.

Электронная микроскопия показала высокую степень однородности частиц коллоидного золота по размерным характеристикам (со средним диаметром 27 нм), что соответствует общепринятым рекомендациям по оптимальному размеру коллоидных частиц для использования в иммунохроматографическом анализе (рис.1).

Рис.1.Электронная микрофотография частиц коллоидного золота
Fig. 1. Electronicmicrography image of the colloidal gold particles
 
Рис.1.Электронная микрофотография частиц коллоидного золота
Fig. 1. Electronicmicrography image of the colloidal gold particles

 

Традиционно процесс иммобилизации моноклональных или поликлональных антител на частицах коллоидного золота (КЗ) характеризуют флокуляционой кривой, в которой наблюдаемая в присутствии избытка соли агрегация должна отражать наличие поверхности частиц КЗ, не защищенной иммобилизованным белком (Hermanson, 2008). Для определения концентрации иммуноглобулинсвязывающего белка – протеинаG, оптимального для получения стабильных, неагрегирующихконъюгатов с коллоидным золотом, процесс контролировали по величине D580 в присутствии 10% NaCl (рис. 2).

Рис.2.Изучение стабильности комплекса коллоидного золота с протеиномG методом флокуляции и флокуляционная кривая их взаимодействия
Fig. 2.The study of the stability of colloidal gold complex with a protein G by flocculation method and flocculation curve of their interaction
 
Рис.2.Изучение стабильности комплекса коллоидного золота с протеиномG методом флокуляции и флокуляционная кривая их взаимодействия
Fig. 2.The study of the stability of colloidal gold complex with a protein G by flocculation method and flocculation curve of their interaction

 

Как видно из рисунка 2, полученная зависимость D580 от концентрации белка G соответствуют существующим представлениям о конъюгировании белков с коллоидным золотом. Увеличение количества молекул белка стабилизирует частицы КЗ, предотвращая их агрегацию в растворе с большой ионной силой; при этом D580 возрастает, доходит до максимума и начинает снижаться, выходя на плато. На основании полученной зависимости выбирали концентрацию белка, на 10-15% превосходящую точки выхода D580 на плато, как рекомендовано для обеспечения максимальной стабильности конъюгата. Оптимальная концентрация протеинаG для иммобилизации на коллоидных частицах составила 8 мкг на 1 мл суспензии КЗ.

Диагностическая эффективность ИХА – ВР26 была определена на 962 позитивных и негативных образцах сывороток крови крупного и мелкого рогатого скота, полученых от РГП «Республиканская ветеринарная лаборатория» с представленными результатами серологического тестирования в РА и РСК. Показатели серологической активности в РА и РСК позитивных сывороток представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Показатели серологической активности в РА и РСК позитивных сывороток
Fig. 3.Indicators of serological activity of the positive serum in agglutination and complement fixation test
 
Рис. 3. Показатели серологической активности в РА и РСК позитивных сывороток
Fig. 3.Indicators of serological activity of the positive serum in agglutination and complement fixation test

 

Как видно из рисунка 3, серопозитивными в РА и РСК являются 439 (69,5%) проб сывороток крови крупного рогатого скота (КРС) из 623 исследуемых, и 257 (74,6%) образцов сывороток крови мелкого рогатого скота (МРС) из 339 исследумых. Значительная часть положительно реагирующих сывороток как КРС, так и МРС (до 70%) содержали максимальные титры агглютинирующих (1:400) и комплементсвязывающих антител (1:10), что свидетельствует о наличии у животных активной фазы инфекционного процесса. Следует отметить, что общепринятые серологические тесты – РА и РСК выявляют приблизительно одинаковое количество положительно реагирующих животных. Исходя из показателей серологической активности в РА и РСК, все испытуемые сыворотки КРС и МРС были распределены на четыре группы: 1 гр. – титры антител в РА1:50 и в РСК 1:10++; 2 гр. – РА 1:100 и в РСК 1:10+++; 3 гр. – РА 1:200 и в РСК 1:10++++; 4 гр. – РА 1:400 и в РСК 1:10++++.

Все испытуемые образцы сывороток крови КРС и МРС были исследованы в непрямом варианте ИФА в двух вариантах – с использованием в качестве антигена липополисахарида (ЛПС) бруцелл (в концентрации 10 мкг/мл) и рекомбинантного антигена ВР26 (в концентрации 1 мкг/мл). Это обусловлено тем, что ИФА является более чувствительным методом, чем РА и РСК. Анализ, проведенный различными исследователями на большом поголовье животных из хозяйств с разной степенью распространения бруцеллезной инфекции, свидетельствует о том, что при помощи ИФА всегда дополнительно выявляются животные, не выявленные классическими серологическими реакциями. Зачастую это связано с недостаточным для предела чувствительности РА и РСК низким уровнем иммунного ответа. В исследованиях при помощи ИФА удалось дополнительно выявить от 1,55 до 3,43% инфицированных животных из числа отрицательных в РА и РСК. Зависимость значений оптической плотности (ОП) позитивных сывороток в ИФА от показателей титров антител в РА и РСК представлена на рисунке 4.

Рис. 4. Зависимость значений оптической плотности (ОП) позитивных сывороток в ИФА от показателей титров антител в РА и РСК
Fig. 4. The dependence of the optical density value (OD) of positive serum in ELISA from indicators of antibody titers in the agglutination and complement fixation test
 
Рис. 4. Зависимость значений оптической плотности (ОП) позитивных сывороток в ИФА от показателей титров антител в РА и РСК
Fig. 4. The dependence of the optical density value (OD) of positive serum in ELISA from indicators of antibody titers in the agglutination and complement fixation test

 

Как видно из рисунка 4, антигенная активность рекомбинантного антигена ВР26 при обнаружении противобруцеллезных антител в испытуемых сыворотках методом ИФА по параметрам оптической плотности (ОП) аналогична параметрам ОП при использовании в качестве антигена липополисахарида (ЛПС) бруцелл. Установлено, что значения оптической плотности (ОП) позитивных сывороток в ИФА-ВР26 находятся в прямой зависимости от показателей их титров в РА и РСК. Так, максимально зарегистрированные значения ОП 2,117±0,189 в ИФА-ВР26 отмечены при тестировании позитивных сывороток крови четвертой группы с максимальными титрами в РА – 1:400 и РСК – 1:10. При этом фоновая активность негативных сывороток при использовании рекомбинантного антигена ВР26 (ОП 0,049±0,007) оказалась в два раза ниже аналогичного показателя ОП, полученного на основе ЛПС (ОП 0,136±0,012).

Результаты определения диагностической эффективности ИХА тест-системы на испытуемых образцах сывороток крови КРС и МРС представлены в таблице 1.

 

Таблица 1.Апробация иммунохроматографической тест-системы на основе рекомбинантного антигена ВР26 (ИХА-ВР26)
Table 1. Testing of the immunochromatographic test-system based on recombinant antigen BP26

Методы

Результаты тестирования иммунохроматографической тест-системой ИХА-ВР26

СывороткикровиКРС n=623

Se,

%

Sp,

%

κ

De

P

СывороткикровиМРС n=339

Se,

%

Sp,

%

κ

De

P

ИХА-ВР26+

n=439

ИХА-ВР26-

n=184

ИХА-ВР26+

n=257

ИХА-ВР26-

n=82

РА

+

428

5

97,2

97,4

0,933

0,97

< 0,01

250

3

96,3

97,2

0,926

0,97

< 0,01

-

11

179

7

79

РСК

+

431

2

98,9

98,1

0,954

0,98

< 0,01

253

1

98,7

98,4

0,950

0,98

< 0,01

-

8

182

4

81

ИФА-ЛПС

+

436

7

96,1

99,3

0,953

0,98

< 0,01

255

6

92,6

99,2

0,923

0,97

< 0,01

-

3

177

2

76

ИФА-ВР26

+

439

0

100

100

1

1

< 0,01

257

0

100

100

1

1

< 0,01

-

0

184

0

   82

Примечания:

КРС – крупный рогатый скот;

МРК – мелкий рогатый скот;

Se– чувствительность;

Sp– специфичность;

κ – согласованность;

De – диагностическая эффективность;

P – достоверность.

Как видно из таблицы 1, сывороточные антитела всех серопозитивных по результатам классических реакций – РА и РСК на бруцеллез животных активно связывались с рекомбинантным антигеном ВР26 как в ИФА, так и в ИХА, что свидетельствует о высокой диагностической ценности испытуемой тест-системы.Следует отметить, что в группе РА-отрицательных животных (как КРС, так и МРС) получены положительные результаты ИХА-ВР26при тестировании 18 (11+7) образцов сывороток крови, в группе РСК-отрицательных–12 (8+4) образцов и в группе ИФА-ЛПС-отрицательных– 5 (3+2) образцов. В группе серопозитивных по данным РА животных выявлены как ИХА-отрицательные 8 (5+3) проб, в группе РСК-позитивных – 3 (2+1)пробы, и в группе ИФА-ЛПС-позитивных – 10 (7+3) проб.

Оценку информативности диагностического ИХА-метода производили по следующим параметрам: специфичность (Sp) – доля истинно отрицательных результатов, чувствительность (Se) – доля истинно положительных результатов и диагностическая эффективность (De) – доля правильных результатов. Как видно из таблицы 1, испытуемая тест-система демонстрирует высокие показатели как специфичности (96,3-98,9), так и чувствительности (97,2-98,4) по отношению к классическим серологическим тестам – РА и РСК. Диагностическая эффективность тест-системы (т.е. сумма истинно положительных и истинно отрицательных результатов среди всех исследуемых сывороток) составила 0,97-0,98.Расчет коэффициента каппа (κ) был использован для оценки согласованности полученных результатов между двумя методами исследования. Если κ>0,75, согласованность считается высокой, если 0,4<κ≤0,75 –хороший, менее 0,4 – плохой. В наших исследованиях данный коэффициент достигал значении 0,923-0,954.

Учет и динамика интенсивности проявления аналитической полосы при исследовании испытуемых сывороток методом ИХА представлены на рисунке 5.

1 – положительный; 2 – слабо положительный; 3 – отрицательный
Рис. 5.Учет результатов и динамика интенсивности проявления аналитической полосы в зависимости от показателей оптической плотности испытуемых сывороток
1 –positive; 2 – weak positive; 3 – negative
Fig.5. Analysis of results and display intensity dynamics of the analytical band depending on the optical density of test serum
 
1 – положительный; 2 – слабо положительный; 3 – отрицательный
Рис. 5.Учет результатов и динамика интенсивности проявления аналитической полосы в зависимости от показателей оптической плотности испытуемых сывороток
1 –positive; 2 – weak positive; 3 – negative
Fig.5. Analysis of results and display intensity dynamics of the analytical band depending on the optical density of test serum

 

Как видно из рисунка 5, показатели интенсивности проявления аналитической полосы ИХА на основе рекомбинантного антигена ВР26 (ИХА-ВР26) находятся в прямой зависимости от показателей экстинции (ОП) позитивных сывороток в ИФА как с ЛПС, так и рекомбинантным ВР26. Так, максимальная яркость аналитической полосы достигалась при тестировании положительных сывороток со значениями ОП 0,750-0,800, тогда как нижний предел значений ОП позитивных сывороток, для которого достоверно детектируется окрашивание аналитической зоны, составил 0,250-0,300.

На заключительном этапе апробации было проведено определение специфичности и достоверности результатов иммунохроматографическойтест-системы на 16 контрольных сыворотках –референс-сыворотках позитивной бруцеллезной и негативной (рекомендована МЭБ) («InstitutoG.Caporale», Италия), сыворотках диагностических бруцеллезных моноспецифических anti-abortus и anti-melitensis (производства Казахского научного центра карантинных и зоонозных инфекций – КНЦКЗИ), позитивных бруцеллезных и негативных сыворотках («Покровский завод биопрепаратов», Россия и НПО «Антиген», Казахстан), а также трех сывороток крови аборт-плодов – №43,47 и 109. В качестве отрицательных контрольных сывороток использовали фетальную сыворотку («Sigma», США), сыворотку крови крупного рогатого скота («Панэко», Москва), сыворотки лептоспирозные двух серогрупп (ФГУП «Армавирская биофабрика», Россия) и сыворотку сальмонеллезную (НПО «Биоконт», Россия). Результаты исследования представлены в таблице 2.

 

Таблица 2.Определение специфичности и достоверности результатов иммунохроматографической тест-системы на контрольных (референс) сыворотках
Table 2. Determination of the specificity and reliability of the results of immunochromatographic test-systems using control serum 

Сыворотки крови

 

Blood serum

Методы тестирования

 

Testing methods

РА

 

SAT

РСК

 

CFT

ИФА-ЛПС

 

ELISA-LPS

ИФА-ВР26

 

ELISA-BP26

ИХА

 

ICA

Референс-сыворотка крови позитивная бруцеллезнаяМЭБ («InstitutoG.Caporale», Италия)

1:3200

1:10

1:25600

1:12800

++++

Референс-сыворотка кровинегативная,МЭБ («Instituto G.Caporale», Италия)

РО

РО

РО

РО

РО

Сыворотка крови диагностическая бруцеллезная моноспецифическая anti-abortus (КНЦКЗИ)

1:1600

1:10

1:6400

1:3200

++++

Сыворотка крови диагностическая бруцеллезная моноспецифическая anti-melitensis (КНЦКЗИ)

1:1600

1:10

1:6400

1:3200

++++

Сыворотка крови аборт-плода №43 (ПЦР+) (НЦМР)

1:400

1:10

1: 12800

1:12800

++++

Сыворотка крови аборт-плода №47 (ПЦР+) (НЦМР)

1:400

1:10

1:12800

1:6400

++++

Сыворотка крови аборт-плода №109 (ПЦР+) (НЦМР)

1:400

1:10

1:6400

1:6400

++++

Позитивная бруцеллезная сыворотка крови («Покровский завод биопрепаратов», Россия)

1:400

1:10

1:25600

1:12800

++++

Негативная сыворотка крови («Покровский завод биопрепаратов», Россия)

РО

РО

РО

РО

РО

Позитивная бруцеллезная сыворотка крови (НПО «Антиген», Казахстан)

1:400

1:10

1:25600

1:12800

++++

Негативная сыворотка крови (НПО «Антиген», Казахстан)

РО

РО

РО

РО

РО

Фетальная сыворотка («Sigma», США)

РО

РО

РО

РО

РО

Сыворотка крови крупного рогатого скота («Панэко», Москва)

РО

РО

РО

РО

РО

Сыворотка лептоспирозная агглютинирующая, серогруппа Гебдомадис (ФГУП «Армавирская биофабрика», Россия)

РО

РО

РО

РО

РО

Сыворотка лептоспирозная агглютинирующая, серогруппа Помона (ФГУП «Армавирская биофабрика», Россия)

РО

РО

РО

РО

РО

Сыворотка сальмонеллезная агглютинирующая (НПО «Биоконт»,Россия)

РО

РО

РО

РО

РО

Как видно из таблицы 2, иммунохроматографическая тест-система демонстрирует высокую специфичность при определении противобруцеллезных антител во всех позитивных контрольных референс-сыворотках. Полученные результаты при тестировании ИХА полностью соответствуют исходным характеристикам референс-сывороток, что подтверждает диагностическую эффективность ИХА для выявления зараженных бруцеллезом животных. Достоверность результатов ИХА доказана исследованием референтных сывороток крови от животных свыделенной гемокультуройбруцелл из цельной крови и положительной ПЦР. Высокий уровень специфической активности испытуемых позитивных референс-сывороток подтвержден показателями титров сывороточных антител против ЛПС и рекомбинантного ВР26 в непрямом ИФА – 1:3200-1:25600. При анализе в ИХА всех отрицательных контрольных сывороток отсутствовало окрашивание в аналитической тест-полоске, что свидетельствует о специфичности разработанной ИХА тест-системы.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе рекомбинантного антигена бруцеллВР26 разработана высокочувствительная и специфичная иммунохроматографическая тест-система для экспресс-обнаружения противобруцеллезных антител, предназначенная для серологической диагностики бруцеллеза животных. Высокая диагностическая эффективность ИХА определена на 962 испытуемых образцах сывороток крови крупного и мелкого рогатого скота, а также 16 контрольных референс-сыворотках крови.

 

Финансирование

Работа выполнена по проекту «Разработка технологии производства иммунохроматографической тест-системы для диагностики бруцеллеза на основе рекомбинантных антигенов» в рамках научно-технической программы«Промышленные биотехнологии» на 2014-2016 годы. 

 

REFERENCES

 

  1. Poester F.P., Nielsen K., Samartino L.E., Yu W. Diagnosis of Brucellosis.The Open Veterinary Science Journal, 2010,vol.4, pp. 46-60.
  2. Smirnova E., Vasin A., Sandybaev N.T. et al. Current Methods of Human and Animal Brucellosis Diagnostics.Advances in Infectious Diseases, 2013, vol. 3,pp. 177-184.
  3. Supriya C., Umapathy B., Ravikumar K. Brucellosis: rewiew on the recent trends in pathogenicity and laboratory. Journal of Laboratory Physicians, 2010, vol. 2,pp. 55-62.
  4. Oliveira S.C., Macedo G.C., Almedia L.A. et al. Recent Advances in Understanding Immunity Against Brucellosis: Application for Vaccine Development. The Open Veterinary Science Journal, 2010, vol. 4, pp. 102-108.
  5. Moryon I., Lopez-Goni I. Structure and properties of the outer membranes of Brucella abortus and Brucella melitensis. InternatlMicrobiol, 1998, vol. 1, pp. 19-26.
  6. Dahouk S.A., Nockler K., Scholz H.C. et al. Immunoproteomic characterization of Brucella abortus 1119-3 preparations used for the serodiagnosis of Brucella infections. Journal of Immunological Methods, 2006, vol. 309, pp. 34-47.
  7. Ko K.Y., Kim J.W., Her M. et al. Immunogenic proteins of Brucella abortus to minimize cross reactions in brucellosis diagnosis.Veterinary Microbiology, 2012, vol. 156, pp. 374-380.
  8. Winter A. Outer membrane proteins of Brucella.Ann. Inst. Pasteur Microbiol., 1987,vol. 138, pp. 87-90.
  9. Whatmore A.M. Current understanding of the genetic diversity of Brucella, an expanding genus of zoonotic pathogens. Infect. Genet.Evol.,2009, vol. 9, pp. 1168-1184.
  10. Dahouk S., Hofer E., Tomaso H. et al. Intraspecies Biodiversity of the Genetically Homologous Species Brucella.Appl Environ Microbiol.,2012, vol. 78, no. 3, pp. 1534-1543.
  11. Cassataro J., Pasquevich K., Bruno L. et al. Antibody Reactivity to Omp31 from Brucella melitensis in Human and Animal Infections by Smooth and Rough Brucellae.Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2004, vol. 11, no. 1,pp. 111-114.
  12. Matar G.M., Khneisser I.A., Abdelnoor A.M. Rapid Laboratory Confirmation of Human Brucellosis by PCR Analysis of a Target Sequence on the 31-Kilodalton Brucella Antigen DNA.Journal of Clinical Microbiology, 1996, vol. 34, no. 2,pp. 477-478.
  13. Ficht T., Bearden S., Sowa B., Adams L. DNA sequence and expression of the 36-kilodalton outer membrane protein gene of Brucella abortus.Infection and Immunity,1989, vol.57, no. 11,pp.3281-3291.
  14. Bricker B.J., Tabatabai L.B., Judge B.A. et al. Cloning, Expression, and Occurrence of the Brucella Cu-Zn Superoxide Dismutase.Infection and Immunity, 1990, vol. 58, no. 9,pp. 2935-2939.
  15. Tabatabai L.B., Hennager S.G. Cattle Serologically Positive for Brucella abortus Have Antibodies to B. abortus Cu-Zn Superoxide Dismutase.Clinical and Vaccine Immynology, 1994, vol. 1, no. 5, pp. 506-510.
  16. Onate A., Cespedes S., Cabrera A.et al. A DNA vaccine encoding Cu-Zn Superoxide Dismutase of Brucella abortus induced protective immunity in BALB/c mice.Infection and Immunity, 2003, vol. 71, no. 3,pp. 4857-4861.
  17. Mayfield J., Tabatabai L. Recombinant Brucella abortus gene expressing immunogenic protein. United States Patent, no. 5023174, 1991.
  18. Kazak E., Oliveira S.C., Goral G. et al. Brucella abortusL7/L12 Recombinant protein Induces Strong Th1 Response in Acute Brucellosis Patients.Iranian journal of immunology,2010, vol. 7, no. 3,pp. 132-141.
  19. Luo D., Ni B., Li P. et al. Protective Immunity Elicited by a Divalend DNA Vaccine Encoding Both the L7/L12 and Omp16 Genes of Brucella abortus in BALB/c Mice.Infection and Immunity, 2006, vol. 74, no. 5,pp. 2734-2741.
  20. Сloeckaert A., Baucheron S., Vizcaino N., Zygmunt M.S. Use of Recombinant BP26 protein in Serological Diagnosis of Brucella melitensis infection in Sheep.Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2001, vol. 8,no. 4,pp. 772-775.
  21. Gupta V.K.,Kumari R., Vohra J. et al. Comparative evaluation of recombinant BP26 protein for serological diagnosis of Brucella melitensis infection in goat. Small Ruminant Research,2010, vol. 93,pp. 119-125.
  22. Xin T., Yang H., Wang N. et al. Limitations of the BP26 Protein-Based Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Diagnosis of Brucellosis. Clinical and vaccine immunology,2013, vol. 20,no. 9,pp. 1410-1417.
  23. Seco-Mediavilla P., Verger J.M., Grayon M. et al. Epitope mapping of the Brucella melitensis BP26 immunogenic protein: usefulness for diagnosis of sheep brucellosis.Clinical and diagnostic laboratory immunology, 2003, vol. 10, pp. 647-651.
  24. Cloeckaert A., Baucheron S., Vizcaino N., Zygmunt M. Use of recombinant BP26 protein in serological diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep.Clinical and diagnostic laboratory immunology, 2001, vol.8,pp. 772-775.
  25. Liu W., Hu S., Qiao Z. et al. Expression, purification and improved antigenic specificity of a truncated recombinant BP26 protein of Brucella melitensis M5-90: a potencial antigen for differencialserodiagnosis of brucellosis in sheep and goats.Biotechnol. Appl. Biochem., 2011, vol.58,pp. 32-38.
  26. Lim J., Kim D., Lee J. et al. Evaluation of recombinant 28kDa outer membrane protein of Brucella abortus for the clinical diagnosis of bovine brucellosis in Korea.J. Vet. Med. Sci., 2012, vol. 74,pp. 687-691.
  27. Thavaselvam D., Kumar A., Tiwari S. et al. Cloning and expression of the immunoreactiveBrucella melitensis 28 kDa outer-membrane protein (Omp28) encoding gene and evaluation of the potential of Omp28 for clinical diagnosis of brucellosis. Journal of Medical Microbiology,2010, vol. 59,no. 4,pp. 421-428.
  28. Qiu J., Wang W., Wu J., Zhang H. Characterization of periplasmic protein BP26 epitopes of Brucella melitensis reacting with murine monoclonal and sheep antibodies.PLoS ONE, 2012, no. 7(3), pp.e34226.
    CrossRef
  29. Kumar S.,Tuteja U., Kumar A., Batra H. Expression and purification of the 26kDa periplasmic protein of Brucella abortus a reagent for the diagnosis of bovine brucellosis.Biotechnol. Appl. Biochem., 2008, no. 49, pp. 213-218.
    CrossRef
  30. Hosseini S., Azizpour M., Akbari N., Basiri H. Amplification,cloning and expression of Brucella melitensisbp 26 gene (OMP28) isolated from Marcazi and purification of Bp26 protein.Archives of Razi Institute, 2013, vol. 68,no. 2,pp. 111-116.
  31. Kim D., Park J., Kim S., Sox Y. Brucella Immunogenic BP26 Forms aChannel-like Structure.J. Mol. Biol., 2013, no. 425, pp. 1119-1126.
    CrossRef
  32. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodiperse gold suspensions.Nat. Phys. Sci,1973,vol. 241,20 р.
  33. Hermanson G.T. Preparation of colloidal-gold-labelled-proteins.London. Bioconjugate Techniques.Academic Press, 1996,593 р.
  34. Bradford M.A. A rapid and sensitive method fer the qvantitation of microgram qvantitaties of protein utilizing the principle of protein – due binding.Anal.biochem.,1976, vol. 72, no. 4, pp. 248-254.
  35. Koichubekov B.K., Sorokina M.A., Bukeeva А.О. Biostatistics in examples and problems. – Almaty, 2012. – 80 p.

 

РЕКОМБИНАНТТЫ АНТИГЕН НЕГІЗІНДЕ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЯЛЫҚ ТЕСТ-ЖҮЙЕСІН БРУЦЕЛЛЕЗДІ СЕРОЛОГИЯЛЫҚ БАЛАУДА ҚОЛДАНУ

 

МанатЕ., СаринаН.Ы., ЕскендіроваС.З., ШустовА.В., МұқановҚ.Қ.
Ұлттық биотехнология орталығы
Ш.
Уалиханов к-сі, 13/1, Астана, 010000, Қазақстан
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ТҮЙІН

Қазақстан Республикасының тәжірибелік ветеринарлық қызметі мен ғылыми потенциалдың бірлескен күшімен қол жеткізген жетістіктеріне қарамастан, жануарлардың бруцеллезін жою мәселесі толығымен шешілген жоқ. Адамдардың бруцеллезбен ауырып-сырқаттануының тұрақты жоғары деңгейі эпизоотиялық жағдайдың шиеленісіне негізделген және бұл инфекцияның жалпы инфекциялық патологиясының құрылымының ерекше маңыздылығын үлкен әлеуметтік-экономикалық зияндылығын анықтайды. Бруцеллезді балайтын серологиялық әдістердің телімділігі мен сезімталдылығын жоғарылату мүмкіндігінің бірі, қазіргі уақытта зерттелінген және спектрі толық анықталған, патогенді бруцеллалардың иммунодоминантты ақуыздарының рекомбинантты аналогын қолдану болып табылады. ВР26 периплазматикалық ақуызы Brucella барлық туысы үшін консервативтілігі жоғарытелімді антиген болып табылады, және медицина мен ветеринарияда пайдалану үшін бруцеллезге иммуноферментті және иммунохроматографиялық тест-жүйесін әзірлеу үшін қолдануда балаулық құндылығы өте жоғары.

Бруцелланың ВР26 рекомбинантты антигені негізінде бруцеллезге қарсы антиденелерді жедел-анықтау үшін, жануарлардың бруцеллезін серологиялық балау үшін арналған телімділігі мен сезімталдылығы жоғары иммунохроматографиялық тест-жүйесі әзірленді. ИХТ жоғары балаулық тиімділігі ұсақ және ірі қара малдардың 962 қан сарысуының зерттеу үлгілерінде, сонымен қатар 16 бақылаулық референс-қан сарысуларында анықталды.

Негізгі сөздер:иммунохроматографиялық тест-жүйесі, рекомбинантты антиген, қан сарысуы, антидене.