4/2016

 

DEVELOPMENT OF T-VECTOR FOR DIRECT CLONING OF PCR PRODUCTS

 

Gritsenko D.A.1,2, Kenzhebekova R.T.1, Deryabina N.D.3, Galiakparov N.N.1,2
1Institute of plant biology and biotechnology
Timiryazevstreet, 45, Almaty,050040,Kazakhstan
2Institute of plant protection and quarantine
Kazybekbistreet, 1, Almaty, 050000,Kazakhstan
3Al-Farabi Kazakh National Universit,
Al-Farabi Street, 71,Almaty,050000, Kazakhstan

This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ABSTRACT

Thermostable enzymes that lack3′ to 5′ exonuclease activity are able to add deoxyadenosine residues to 3′-overhangs in PCR-amplified products, thereby allowing direct cloning of PCR products into T-vectors. A T-vector for cloning of amplified products was created by inserting two Eam1105I restriction sites in the multiple cloning site of the plasmid pGEM‑3zf(+). The ‘excess’Eam1105I restriction site within theβ-lactamase gene was deleted by point mutation while maintaining the amino acid sequence. Addition of a spacer (282 nucleotides) between the Eam1105I sites increased the cleavage efficiency of the enzyme. The developed T-vector reduces the time and cost for cloning PCR products as compared to other methods involvingT-vector preparation with enzymatic addition of deoxythymidine to 3′-ends, primer design with suitable restriction sites, and restriction enzyme digestion of PCR products. The developed vector was used to clone the open reading frames of different sizes of grapevine virus A.

Keywords: T-vector, PCR products, cloning.

 

УДК 577.29

 

СОЗДАНИЕ Т-ВЕКТОРА ДЛЯ ПРЯМОГО КЛОНИРОВАНИЯ ПЦР-ПРОДУКТОВ

 

ГриценкоД.А.1,2, КенжебековаР.Т.1, ДерябинаН.Д.3,ГалиакпаровН.Н.1,2
1Институт биологии и биотехнологии растений
ул. Тимирязева, 45,Алматы,050040, Казахстан
2Институт защиты и карантина растений
ул. Казыбек би,1, Алматы, 050000, Казахстан
3Казахский Национальный Университет им. аль-Фараби
ул. Аль-Фараби,71, Алматы,050000, Казахстан

d.kopytina@gmail.com

 

АБСТРАКТ

При использовании в полимеразной цепной реакции (ПЦР) термостабильных ферментов без 3'-5'-экзонуклеазной активности продукты амплификации имеют на 3’-концах обеих цепей ДНК неспаренный и неспецифичныйдезоксинуклеотид, в основном дезоксиаденозин. Эта особенность некоторых полимераз добавлять некодируемыйдезоксиаденозиндает возможность прямого клонирования продуктов ПЦР в так называемыйТ-вектор. Т-вектор для клонирования амплифицированных продуктов был создан путем вставки двух рестрикционных сайтов Eam1105I в сайт множественного клонирования плазмидыpGEM3zf(+).«Лишний» рестрикционный сайт Eam1105I в гене β-лактамазы удален путем точечной мутации, с сохранением аминокислотной последовательности. Расщепление по сайтам Eam1105I оставляет свободные дезокситимидины на 3'-концах ДНК вектора, что дает возможность напрямую клонировать ПЦР-продукты. Внесение спейсера– 282 пары нуклеотидов ДНК – между сайтами Eam1105I повышает эффективность расщепления их ферментом. Сконструированный Т-векторсокращает время и затраты клонирования ПЦР-продуктов по сравнению с другими методами, требующимиподготовку Т-вектора, путем ферментативного добавления дезокситимидинов на 3'-концы, дизайнпраймеров с подходящими рестрикционными сайтами и расщепления ПЦР-продуктов рестриктазами. Полученный вектор использовался для клонирования открытых рамок считывания вируса А винограда разного размера.

Ключевые слова: Т-вектор, ПЦР-продукты, клонирование.


ВВЕДЕНИЕ

Клонирование ДНК используется во многих областях молекулярной биологии, а именно в получении рекомбинантных белков, создании геномных библиотек, генной терапии, в создании трансгенных растений и так далее. Клонирование ДНК в нужный вектор может осуществляться путем использования соответствующих рестрикционных сайтов, путем прямого клонирования ПЦР-продуктов, либо используя лигазонезависимый метод. В случае использования соответствующих рестрикционных сайтов фрагмент ДНК для клонированиярасщепляется необходимыми эндонуклеазами, которые имеются как в ДНК, так и в векторе, в который будет внедрен фрагмент ДНК. Клонирование может осуществляться как по «липким», так и по «тупым» концам в зависимости от того, как расщепляет эндонуклеаза молекулу ДНК. Данный метод очень удобен для субклонирования, когда необходимый фрагмент ДНК переносится из одного вектора в другой. Например, в случае переноса из вектора для клонирования в вектор для экспрессии генов. Для клонирования ПЦР-продуктов данный метод имеет ряд недостатков. Прежде всего, необходимо вносить рестрикционные сайты в праймера, если рестрикционные сайты находятся рядом с концами амплифицированной молекулы ДНК, их эффективность расщепления намного снижается [1]. Внесение рестрикционных сайтов в праймера может повлечь за собой проблемы амплификации нужного фрагмента ДНК. Лигазонезависимыйметод при клонировании ПЦР-продуктов требует наличия дополнительных 10-12 неспаренных нуклеотидов на 3'-концах амплифицированной молекулы ДНК. Данные неспаренные концы в дальнейшем отжигаются с комплементарными концами соответствующего вектора. Недостатками данного метода для клонирования ПЦР-продуктов является необходимость синтеза очень длинных праймеров и модифицированных методов амплификации [2]. Прямое клонирование ПЦР-продуктов является удобным способом получения нужных рекомбинантных молекул для дальнейшего анализаамплифицированных продуктов без дополнительных их модификаций и считается рутинным методом в рекомбинантных технологиях. Использование данного метода возможно благодаря Taq-полимеразе, которая добавляет дезоксиаденозины на 3'-концах ПЦР-продуктов. Клонирование амплифицированных продуктов осуществляется в Т-вектор, который имеет на 3'-концах свободные дезокситимидины. Существует несколько стратегий создания Т-векторов, одна из них использует рестрикцию вектора, с образованием тупых концов и с последующим ферментативным добавлением дезокситимидинов на 3'-концы с помощью Taq-полимеразы или терминальной трансферазы [3]. Также получение Т-вектора возможно путем использования эндонуклеазAhdI,BciVI, BfiI, HphI, MnlI, TaaI и XcmI[4-7], после расщепления которыми на 3'-концахостаются свободные дезокситимидины.

Первый метод широко используется, но имеет ряд недостатков, которые включают такие факторы как: получение большого количества колоний, не несущих целевого ПЦР-фрагмента в векторе ввиду неполного расщепления всех молекул плазмиды, неравномерного добавления на 3'-концы дезокситимидинов, требование тщательной очистки плазмиды перед клонированием. Преодоление данных проблем стало возможным благодаря использованию второго метода. Неполное расщепление вектора стало возможно визуализировать и преодолеть благодаря внесению между сайтами вышеупомянутыхэндонуклеазспейсеров. Известно, что близкорасположенные сайты рестрикции не полностью расщепляются из-за плохого узнавания сайтов ферментами, внесение дополнительных вставок между ними повышает эффективность расщепления [8].После расщепления такимиэндонуклеазами, в частности Eam1105I, дезокситимидины присутствуют на обоих 3'-концах вектора, что в разы повышает эффективность клонирования. Создание Т-вектора дает возможность быстро отбирать нужные амплифицированные продукты и использовать их в дальнейших целях. В случае клонирования разных открытых рамок считывания вируса А винограда в созданный Т-вектор дается возможность модифицировать геном вируса путем внесения дополнительных последовательностей ДНК, а также изменить последовательность гена, кодирующего белок оболочки.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы и вектора

В работе был использован штамм бактерий Escherichiacoli DH5. Для создания Т-pGEM-3zf(+)вектора использовалась плазмида pGEM3zf+. Амплификация открытых рамок считывания вируса А винограда осуществлялась при использовании вектора pCASS-GVA, несущего полный геном инфекционного клона данного вируса.

 

Среды

Была использована среда Луриа-Бертани(ЛБ) Sigma-Aldrich, концентрация антибиотика ампициллина составляла 100 ug/ml.

 

Реактивы

Все реактивы, использованные в работе, были производства Sigma-Aldrich, ThermoScientific с категорией чистоты «Для молекулярной биологии».

 

Удаление сайта Eam1105I из гена, кодирующего β-лактамазув плазмиде pGEM3zf(+)

Ген, реализующий устойчивость к ампициллину, кодирующий β-лактамазу в плазмиде pGEM3zf(+), содержит рестрикционный сайтEam1105I, как это показанона рисунке 1. Удаление сайта проводилось ПЦР-методом с помощью специфичных праймеров, которые изменяли последовательность Eam1105I сайта без изменения аминокислотной последовательностиβ-лактамазы. Амплификация проводилась в 25 мкл реакционной смеси, состоящей из 2.5 мкл 10Х Pfuбуфера (200 мМTrisHCl, pH 8.8, 100мМ (NH4)2SO4,100 мМ КСl, 1 мг/мл BSA, 1% TritonX-100), 2.5 мМMgSO4, 0.2мМдНТФ, 2 мМ каждого праймера (5’-tgcctgggaccccgtagtgtagataac-3’ и 5’-actatggatgaacgaaatagacagatc-3’), 2,5 ед. Pfu полимеразы и 30 нг плазмиды pGEM3zf(+).

Рис. 1.ИзображениевектораpGEM3zf+
Fig. 1.Image of pGEM 3zf+vector
 
Рис. 1.ИзображениевектораpGEM3zf+
Fig. 1.Image of pGEM 3zf+vector

 

Амплификацию проводили в следующем режиме: первоначальная денатурация при 94оС в течение 2 мин, 25 циклов,состоящих из денатурации при 94оС – 20 сек., отжига праймеров при 54оС – 30 сек. и элонгации при 72оС – 4 мин., после 25 циклов инкубация при 72оС – 15 мин.

После амплификации 2 мкл реакционной смеси наносили в 1% агарозный гель для анализа продуктов амплификации. Оставшуюся реакционную смесь подвергали гидролизу эндонуклеазойDpnI. Эндонуклеаза рестрикции DpnIгидролизуетпоследовательность 5’-GATC-3’ только при наличии метилированного основания гуанидина[8]. Отсутствие метилирования в продукте ПЦР препятствует расщеплению ДНК, но происходит расщепление плазмиды, которая выступала в роли матрицы. Реакцию проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей буфер DpnI(ThermoScientific), 23 мкл ПЦР-продукта, 5 ед.эндонуклеазыDpnIпри 37оС в течение 1 часа,с последующейинактивацией фермента при 80оС в течение 20 минут. Интактная ДНК ПЦР-продукта очищалась и подвергалась самолигированию в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1хТ4 буфера лигазы (ThermoScientific), 150 нг очищенного ПЦР-продукта и 5 ед. Т4 ДНК лигазы (ThermoScientific). Реакционная смесь,после инкубации при +4оС в течение 14 часов, использовалась для трансформации бактерий. Полученнаяплазмидас удаленнымEam1105I сайтом в гене β-лактамазымаркирована какm-pGEM 3zf(+).

 

Внесение рестрикционных сайтов Eam1105I в область множественного клонирования плазмидыm-pGEM 3zf(+)

Два праймера, 5’-tcgaccgaccttgagtctctagagacctaacgtcag-3’ и 5’-gatcctgacgttaggtctctagagactcaaggtcgg-3’, по 2мМ каждого,в присутствии 75 мМTrisHCl, pH 8.8, 20мМ (NH4)2SO4, 0.01% Tween 20, 2,5 мМMgCl2, в общем объеме 25 мклнагревались до 94оС в течение 2 минут, далее медленно остужались до 20оС. Полученная двухцепочечная ДНК имела на обоих 5’-концах по четыре не спаренных нуклеотида, соответствующих остаткам после расщепленияферментамиBamHI и SalI. Двухцепочечная часть ДНК содержит два сайта Eam1105I и один рестрикционный сайт XbaI между ними. 5 мкл из смеси было взято для лигирования с плазмидойm-pGEM3zf(+), расщепленной по сайтам BamHI и SalI ипоследующей трансформации бактерий E.coli штамма DH5[9]. Полученные клоны были проверены на наличие вставленной последовательности рестрикцией по сайтам BamHI и SalI и секвенированием. Плазмидаm-pGEM3zf(+), содержащая рестрикционные сайты Eam1105I, была названа Т-3zf(+).

Для эффективной рестрикции ферментом Eam1105Iи лучшей визуализации на агарозном геле результата расщепления, по рестрикционному сайту XbaI, между сайтами Eam1105I внесен фрагмент ДНК (спейсер) размером в 282 пар нуклеотидов. Клонирование проводили в 10 мкллигазной смеси, содержащей1хбуфер Т4 ДНК лигазы(ThermoScientific), 60 нгспейсера, 80 нгдефосфорилированогоТ-3zf(+), расщепленного по XbaI сайтуи 5 ед. Т4 ДНК лигазы (ThermoScientific). Реакционная смесь инкубировалась при +4оС в течение16 часов с последующей трансформацией бактерий E.coli штамма DH5. Анализ на наличие спейсера проводился рестрикцией по сайтам Eam1105I. Вектор Т-3zf(+) со спейсером между сайтами Eam1105I назван T-pGEM3zf+.

 

Проверка эффективности полученного Т-вектора

Для проверки эффективности клонирования ПЦР-продуктов в созданный Т-вектор использовались фрагменты генома вируса А винограда размером 2500 п.н (участок 2-5 ОРС), 750 п.н (ОРС4), 400 п.н (ОРС5), синтезированные с помощью специфичных праймеров (таблица 1). Амплификацию этих фрагментов проводили в 25 мкл, содержащих буфер полимеразы (20 мМTrisHCl, pH 8.8, 10мМ (NH4)2SO4,10 мМ КСl, 1 мг/мл BSA, 0,1% TritonX-100), 2.5 мМMgSO4, 0.2мМдНТФ, 2 мМ каждого праймера, 2,5 ед. Taq-полимеразыи 40 нг вектора pCASS-GVA,несущего полный геном вируса А винограда.Амплификацию проводили в следующем режиме: первоначальная денатурация при 94оС в течение 2 мин, 30 циклов состоящих из денатурации при 94оС – 20 сек., отжигапраймеровв течение 30 сек.при 50оС, 56оС и 47оС для 2500 п.н., 750 п.н. и 400 п.н., соответственно, и элонгации при 72оС –от 30 до 90 сек., в зависимости от размера продукта, после30 циклов финальная инкубация при 72оС – 15 мин.

 

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов для амплификации участков генома вируса А винограда различных размеров
Table 1. The sequences of oligonucleotides for the amplification of the  grapevine virus A genome

РазмерпродуктаПЦР, парнуклеотидов

 

The size of PCR product, base pairs

Последовательностьпраймеров

 

The sequence of the primers

400

5’-actgtgatacaggctatgca-3’

5’-ctcatcgtctgaggtttcta-3’

750

5’-gaagacatatggcacactacgccaag-3’

5’-aaacgtggatccacccgcgagaaacg-3’

2500

5’-ататаgacgtcgatgctcagcaag-3’

5’-ctcatcgtctgaggtttcta-3’

 

Очистка амплифицированных последовательностей осуществлялась из агарозного геля с помощью кита GeneJETGelExtractionKit (ThermoFisherScientific).Лигированиепродуктов ПЦР в плазмиду Т-pGEM-3zf(+) проводили в 10 мкл, содержащих1хбуфер Т4-ДНК лигазы (ThermoScientific), 300 нг очищенного ПЦР продукта,100 нг вектора, порезанного по сайтам Eam1105I,5 ед. Т4-ДНК лигазы (ThermoScientific). Реакционная смесь инкубировалась при +4оС 16 часов с последующей трансформацией клеток E.coli штамм DH5α.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Создание Т-вектора было осуществлено в три этапа: удаление сайта Eam1105Iиз гена, кодирующего β-лактамазу; внесение сайтовEam1105I в область множественного клонирования плазмидыm-pGEM 3zf(+); внесение спейсера между сайтами Eam1105I. На рисунке 2 изображена нуклеотидная последовательность распознавания ферментом Eam1105I. 

Рис. 2. Изображение нуклеотидной последовательности, распознаваемой эндонуклеазойEam1105I
Fig. 2. Image of nucleotide site recognized by Eam1105I
 
Рис. 2. Изображение нуклеотидной последовательности, распознаваемой эндонуклеазойEam1105I
Fig. 2. Image of nucleotide site recognized by Eam1105I

 

Нарисунке 3 изображена стадия удаления сайта Eam1105I из гена, кодирующего β-лактамазу, с помощью точечных мутаций четырех нуклеотидов.После удаления сайта Eam1105I из гена β-лактамазыаминокислотная последовательность фермента сохранена прежней. 

Рис. 3. Иллюстрация получения m-pGEM3zf+вектор
Fig.3. The illustration of obtaining of m-pGEM3zf+vector
 
Рис. 3. Иллюстрация получения m-pGEM3zf+вектор
Fig.3. The illustration of obtaining of m-pGEM3zf+vector

 

На рисунке 4приведена схемаполученного Т-вектора, содержащегоспейсер между сайтами Eam1105I.

Рис.4. Иллюстрация вектора T-pGEM3zf+
Fig.4.The illustration of T-pGEM3zf+vector
 
Рис.4. Иллюстрация вектора T-pGEM3zf+
Fig.4.The illustration of T-pGEM3zf+vector

 

Внесенная олигонуклеотидная последовательность в 49 п.н с Eam1105I сайтами в сайт множественного клонирования вектора m-pGEM3zf(+) была анализирована секвенированием с использованием Т7-праймера и BigDyeTerminatorv3.1 на генетическом анализаторе ABIPrism 310. Анализ вставкиспейсера между Eam1105Iсайтами по сайту XbaI проводился рестрикцией по сайтам EcoRI и HindIII, для работы был отобран 1-й клон(рис.5).

М – маркер GeneRuler 1 kbplus DNA Ladder; 1-5 – клоны Т-вектора со вставкой по сайту XbaI
Рис.5. Изображение гель-электрофореза расщепления Т-вектора по сайтам EcoRI и HindIII
M–marker ( GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder); from 1 to 5 – clones of T-vector that contain the spacer between Eam1105I sites
Fig.5. Gel electrophoresis analysis of the cleavage of T- vector with HindIII and EcoRI sites
 
М – маркер GeneRuler 1 kbplus DNA Ladder; 1-5 – клоны Т-вектора со вставкой по сайту XbaI
Рис.5. Изображение гель-электрофореза расщепления Т-вектора по сайтам EcoRI и HindIII
M–marker ( GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder); from 1 to 5 – clones of T-vector that contain the spacer between Eam1105I sites
Fig.5. Gel electrophoresis analysis of the cleavage of T- vector with HindIII and EcoRI sites

 

После полного расщепления отобранного клона Т-вектора по сайтам Eam1105Iлинеаризованный вектор с неспаренными дезокситимидинами на 3'-концах элюировался из геля с помощью GeneJETGelExtractionKit и использовался для клонирования последовательностей 2500 п.н. (участок 2-5 ОРС вируса А винограда), 750 п.н. (ОРС4), 400 п.н. (ОРС5).

Эффективность клонирования определялась по количеству клонов со вставкой из общего количества выделенных плазмид. Для каждого размера ПЦР-продукта выделялись плазмиды из 10 рандомизированно отобранных колоний трансформированных бактерий. Наличие вставки проверялось рестрикцией ферментами EcoRI и HindIII и последующим разделением в агарозном геле (рис.6).

А. 1-10 –плазмиднаяДНК,выделеннаяиз 10 колоний (Т-pGEM-3zf(+)+ 2500 п.н); Б. 1-10 –плазмиднаяДНК,выделеннаяиз 10 колоний (Т-pGEM-3zf(+)+ 750 п.н); В. 1-10 –плазмиднаяДНК,выделеннаяиз 10 колоний (Т-pGEM-3zf(+)+ 400 п.н); М–маркерGeneRuler 1 kb DNA Ladder
Рис. 6. Изображение гель-электрофореза расщепления рекомбинантного Т-вектора по сайтам EcoRI и HindIII
A. 1-10 – plasmid DNA was isolated from 10 colonies (T-pGEM-3zf (+) + 2500 bp);Б. 1-10 – plasmid DNA was isolated from 10 colonies (T-pGEM-3zf (+) + 750 bp); B. 1-10 – plasmid DNA was isolated from 10 colonies (T-pGEM-3zf (+) + 400 bp); M – marker ( GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder)
Fig. 6. Gel electrophoresis analysis of the cleavage of the recombinant T-vector with HindIII and EcoRI sites
 
А. 1-10 –плазмиднаяДНК,выделеннаяиз 10 колоний (Т-pGEM-3zf(+)+ 2500 п.н); Б. 1-10 –плазмиднаяДНК,выделеннаяиз 10 колоний (Т-pGEM-3zf(+)+ 750 п.н); В. 1-10 –плазмиднаяДНК,выделеннаяиз 10 колоний (Т-pGEM-3zf(+)+ 400 п.н); М–маркерGeneRuler 1 kb DNA Ladder
Рис. 6. Изображение гель-электрофореза расщепления рекомбинантного Т-вектора по сайтам EcoRI и HindIII
A. 1-10 – plasmid DNA was isolated from 10 colonies (T-pGEM-3zf (+) + 2500 bp);Б. 1-10 – plasmid DNA was isolated from 10 colonies (T-pGEM-3zf (+) + 750 bp); B. 1-10 – plasmid DNA was isolated from 10 colonies (T-pGEM-3zf (+) + 400 bp); M – marker ( GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder)
Fig. 6. Gel electrophoresis analysis of the cleavage of the recombinant T-vector with HindIII and EcoRI sites

 

На рисунке 6 блок А видно наличие вставки размером 2500 пар нуклеотидов в пяти клонах из 10. Для ПЦР продуктов размером 400 и 750 пар нуклеотидов соотношение позитивных клонов к негативным составило 9:1. Таким образом эффективность клонирования для 2500 нуклеотидов составила 50%, а для 750 и 400 п.н– 90%. ПЦР-продукты, клонированные в полученный вектор, могут быть секвенированы с использованием универсальных М13 прямой, М13 обратный, Т7 или SP6 праймеров. Так же, без модификаций могут быть использованы для синтеза РНК с помощью Т7 или SP6 РНК полимераз для использованияinvitro трансляции или в качестве РНК проб, например, для норзернблота.

Таким образом, эффективность клонирования для 2500 нуклеотидов составила 50%, а для 750п.н. и 400 п.н.–90%.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование Т-векторов в рекомбинантных технологиях в настоящий момент является одним из эффективных методов клонирования ПЦР-продуктов. Для создания Т-вектора использовался мутагенез β-лактамазы методом ПЦР, а также внесение двух Eam1105I сайтов в область множественного клонирования плазмидыpGEM3zf+. Кроме того, внесенный спейсер между сайтами рестрикции Eam1105I дал возможность визуализироватьрезультат расщепления Т-вектора по сайтам Eam1105I.Созданный Т-вектор использовался для клонирования ДНК фрагментов разных размеров с эффективностью для фрагментов 400, 750 п.н. – 90%, а для фрагмента размером 2500 п.н.– 50.

 

Финансирование

Работа выполнена в рамках проекта «Разработка вирусного вектора для получения рекомбинантных белков в растениях» (1334/ГФ4).

 

REFERENCES

 

 

  1. Kaufman D.L.,Evans G.A. Restriction endonuclease cleavage at the termini of PCR products.Biotechnique,1990,vol.9,pp. 306.
    PubMed
  2. Holton T.A., Graham M.W. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.Nucleic Acids Res, 1991, vol.19, pp.1156.
    PubMed
  3. Cha J., Bishai W., Chandrasegaran S. New vectors for direct cloning of PCR products.Gene, 1993, vol. 136, pp.369-370.
    PubMed
  4. Jo C., Jo S.A. A simple method to construct T-vectors using Xcm I cassettes amplified by nonspecific PCR. Plasmid, 2001, vol.45, pp. 37-40.
    PubMed
  5. 5.Kovalic D.J., Kwak H., Weisblum B. General method for direct cloning of DNA fragments generated by the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res, 1991, vol.19.
    PubMed
  6. Yaofeng Zhao. Construction of a High Efficiency PCR Products Cloning T-vector Using pGEM-5zf (+).Avicenna J Med Biotechnol,1991, vol.1, pp. 37-39.
    PubMed
  7. Shu-Ye Jiang, JeevanandamVanitha, Yanan Bai, Srinivasan Ramachandran.A Novel Binary T-vector with the GFP Reporter Gene for Promoter Characterization.PLoS One, 2014, vol.9, pp.1-11.
    CrossRef
  8. Lacks S., Greenberg B. Complementary specificity of restriction endonucleases of Diplococcus pneumoniae with respect to DNA methylation. J. Mol. Biol, 1977, vol.114, pp. 153-168.
    PubMed
  9. FrogerA.Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.J Vis Exp, 2007, vol. 2007, pp. 253.
    PubMed

 

ПТР ӨНІМДЕРІН ТУРА КЛОНДАУ ҮШІН Т-ВЕКТОРЫН ЖАСАУ

 

Д.А. Гриценко1,2*, Р.Т. Кенжебекова1, Н.Д. Дерябина3, Н.Н. Галиакпаров1,2
Өсімдіктер биологиясы және биотехнологиясы институты, Тимирязева к-сі, 45,Алматы,050040, Қазақстан
Өсімдіктер карантині және қорғау институты,
 Қазыбек би к-сі, 1, Алматы, 050000, Қазақстан
Әл-Фараби атындағы Қазақ Ұлттық Университеті,
Әл-Фараби к-сі,71, Алматы,050000, Қазақстан
*This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ТҮЙІН

Полимеразді тізбек реакциясында (ПТР) термотұрақты 3'-5'-экзонуклеазалық  белсендіксіз ферменттерді пайдаланған жағдайда, амплификация өнімдерінде ДНҚ-ның  екі тізбегінің 3’-аяғында көбінесе дезоксиаденозин жұптаспаған және спецификалық емес дезоксинуклеотид пайда болады. Кейбір полимеразалардың кодталмайтын дезоксиаденозинді қосу ерекшелігі, аталған Т-векторға ПТР өнімдерін тұра клондау мүмкіндігін береді. Амплификация өнімдерін клондау үшін, екі Eam1105I рестрикциялық сайттарды pGEM 3zf(+) плазмиданың көптеген клондау сайтына енгізу арқылы Т-векторы жасалынды. «Артық» Eam1105I рестрикциялық сайты β-лактомазаның генінде  аминоқышқылдық ретін сақтай отырып, нүктелік мутациямен жойылған. Eam1105I сайттарында ажырауы ДНҚ вектордың 3'-аяғында бос дезокситимидиндерді қалдырады, яғни ПТР өнімдерін тура клондау мүмкіндігін береді. Eam1105I сайттардың арасына ДНҚ 282 нуклеотид жұптан тұратын.спейсердің енгізуі фермент арқылы ажырау тиімділігін көбейтеді. Т-векторды дайындау, дезокситимидиндерді ферменттік жолмен 3'-аяғына қосу, қолайлы рестрикциялық сайттармен праймерлердің дизайны, ПТР өнімдерін рестриктазалармен ажырауды қажет ететін  басқа әдістерге қарағанда, құрастырылған Т-вектор ПТР өнімдерін клондауға арналған уақыт пен шығындарды үнемдейді. Алынған вектор  жүзімнің А -вирусының әртүрлі өлшемдерін ашық түрде оқу және клондау жұмыстарында пайдаланылды.

Негізгі сөздер: Т- вектор, ПТР-өнім, клондау