4/2016

 

IN VITRO CULTURE OF Rhodiola roseaL.

Khapilina O.N., Kupeshev Z.S., Danilova A.N., Kalendar R.N.
National Center for Biotechnology
Kurgalzhyn road, 13/5, Astana, 010000, Kazakhstan
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ABSTRACT

We present the results of our study on in vitro culture of the valuable medicinal plant Rhodiola rosea (Rhodiola rosea L.). We collected sample plant materials from the Kazakh Altai territory. The essential stages of in vitro cultivation techniques for R. rosea were optimized. We determined the most effective sterilization protocol for different types of explants of Rhodiola and optimized stages of organogenesis and formation of adventitious shoots. We found that aseptic cultures of Rhodiola necessitate the use of multi-stage sterilization protocol using different types of antiseptics. Apexes of shoots and rhizome buds were the most effective explants. High concentration of exogenous cytokinin in the culture medium induced adventitious organogenesis in R. rosea. Maximum adventitious shoots (up to 34 explants) were observed usingMSZ1 medium supplemented with zeatin, indole-3-acetic acid, and gibberellic acidat concentrations of 2, 0.1, and 0.5 mg/L, respectively. The formation of the root system wasdependent on the agar concentration in the medium. Morphometric characteristics were higher in regenerated Rhodiolagrown on a medium containing 0.6% agar.

Keywords: golden root, Rhodiola rosea L., in vitro culture, explants, adventitious organogenesis, micropropagation.

 

УДК 633.88:632.937.19:602.6:58

КУЛЬТУРА РОДИОЛЫ РОЗОВОЙ (RHODIOLA ROSEAL.) IN VITRO

Хапилина О.Н., Купешев Ж.С., Данилова А.Н., Календарь Р.Н.
Национальный центр биотехнологии
Кургальжинское шоссе, 13/5, Астана, 010000, Казахстан
 This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.
 

 

АБСТРАКТ

В статье представлены результаты исследований по введению в культуру invitroродиолы розовой (RhodiolaroseaL.). В качестве материала исследований были использованы растения родиолы розовой, собранные в местах ее естественного произрастания на территории казахстанского Алтая.В процессе выполнения исследований проведены эксперименты по введению в культуру invitro ценного лекарственного растения –родиолы розовой. Определены эффективные протокола стерилизации различных типов эксплантов родиолы, оптимизированы этапы органогенеза и образования адвентивных побегов. Установлено, что для получения асептических культур родиолы необходимо использовать многоэтапные протокола стерилизации с применением различных типов антисептиков. В результате исследований показано, что наиболее эффективным типом эксплантов являются апексы побегов, а также корневищные почки родиолы. В присутствии высоких концентраций экзогенных цитокининов происходит индукция адвентивных побегов. Максимальное количество адвентивных побегов (до 34 на эксплант) было зафиксировано при субкультивировании на среде МСZ1, содержащей 2 мг/л зеатина,0,1 мг/л ИУК и 0,5 мг/л гибберелловой кислоты.Формирование корневой системы регенерантов зависело от концентрации агара в питательной среде. Морфометрические характеристики были лучше у тех регенерантов родиолы, которые выращивались на среде с 0,6% агара.

Ключевые слова: золотой корень, родиола розовая, RhodiolaroseaL., культура invitro, экспланты, адвентивный органогенез, микроклональное размножение.


ВВЕДЕНИЕ

Сохранение природного биоразнообразия и рационального использования природных ресурсов является весьма актуальной проблемой. Флора Казахстана включает более 13 тыс. видов, в том числе: более 5754 вида высших сосудистых растений, около 5000 грибов, 485 лишайников, более 2000 водорослей, около 500мохообразных. Среди растений 14% видов являются эндемиками, в их числе немало реликтов. В Красную книгу Республики Казахстан внесено 387 видов растений, в том числе и родиоларозовая(RhodiolaroseaL.) [1].

Родиола розовая является одним из ценных лекарственных растений, в корневищах которого содержатся различные биологически активные компоненты: фенилпропаноиды – розавин, розарин, розин; фенольные соединения – салидрозид, тирозол; флавоноиды – родионин, родиолин, родиозин, ацетилродальгин; фенольные кислоты, монотерпены, танины, глюкозиды и фенольные масла [2].Препараты, созданные на основе корня родиолы, применяют в реабилитационном периоде после операций, травм, тяжелых инфекционных заболеваний в качестве общеукрепляющего средства. Экстракты родиолы розовой входят в состав общеукрепляющих и тонизирующих средств, которые находят все более широкое применение в восстановительной, спортивной медицине и гериатрии[3].

В пределах Республики Казахстан вид встречается в субальпийском и альпийском поясахв высотном пределе 1800-2400 м над уровнем моря на хребтах Казахстанского Алтая: Юго-Западный Алтай (хр. Ивановский, Ульбинский, Холзун, Западная Листвяга); Южный Алтай (хр. Курчумский, Нарымский, Сарым-Сакты, Южно-Алтайский Тарбагатай, Южный Алтай); Центральный Алтай (Чиндогатуйские горы, северо-западная оконечность плато Укок). К числу факторов, определяющих жизненный ритм этого вида, относятся суровый и недостаточно благоприятный метеорологический режим вегетационного периода (суточные перепады температур воздуха, понижение их до отрицательных значений, интенсивная солнечная радиация, сильные и постоянные холодные ветры, летние снегопады, вмерзание в лед, сдувание снега в зимний период и оголение почвы, маломощный, грубоскелетный, крайне бедный питательными веществами почвенный покров, мощно развитый напочвенный покров, препятствующий прогреванию почвы).

Рост популярности данного вида растений среди населения приводит к увеличению сбора подземной части растений и, как следствие этого, истощению природных популяций. Возобновление природных популяций лекарственных растений предполагает выращивание ценных видов в экспериментальных условиях. Микроразмножение считается одним из наиболее коммерчески и экономически важных подходов. Современные методы особенно подходят для видов, которые трудно возобновимы в естественных условиях [4].

На сегодняшний день культивирование invitro и микроклональное размножениеисчезающих видов ценных растений является одним из альтернативных источников получениялекарственного сырья, при этом способствует сохранению природных популяций иявляется актуальным направлением современной биотехнологии.

Технологии микроклонального размножения позволяют ускорить размножение редких и исчезающих видов растений, нуждающихся в охране, и рассчитаны на получение дополнительного источника сырья в виде каллусных тканей и/илисуспензионных культур, а также растений-регенерантов для плантационного выращивания сырья ресурсных лекарственных растений. Растения, полученные методом микроклонального размножения, позволятрешить проблемы здоровья нации, сохранят растительный мир планеты [5].С использованием метода культивирования тканей и органов растений в настоящее время создан ряд клеточных технологий, позволяющих получать ценные вторичные продукты метаболизма растений, такие как гликозиды, алкалоиды, некоторые другие биологически активные вещества, имеющие широкое применение в качестве лекарственных препаратов, пищевых красителей, ароматизаторов и др. [3].

Первые сообщения о культивированииродиолы розовой в условиях invitro были получены в 1980 г. В 1981 г. был получен патент на способ регенерации корней родиолы розовой, но не была представлена информация об условиях индукции каллусогенеза [6]. Из введенных в культуру invitro нескольких видов родиолы (R. crenulata, R. kirilowii, R. quadrifida, R. sachalinensis) родиоларозовая является наиболее требовательной к условиям культирования [7]. Это подтверждают последующие публикации, в которых были представлены довольно противоречивые результаты. Анализ литературы показывает, что для каждого конкретного случая оптимальные условия определяются экспериментально. Следует отметить, что успешные результаты по индукции органогенеза invitroбыли получены при использовании всех органов растения родиолы розовой. Наибольшее предпочтение в большинстве работ отдается листовым эксплантам [8, 9] вследствие удобства стерилизации, а также апикальным и корневищным почкам [10]. Менее часто используются стволовые сегменты (междоузлия и листовые узлы), а такжесегменты корневищ [11].Практически в каждой отдельной работе по культивированиюродиолырозовой invitro предлагаются самостоятельные протоколы культивирования, определяющие состав и концентрацию регуляторов роста, из которых наиболее часто используются 6-бензиламинопурин (BAP), индол-3-уксусная кислота (IAA), L-нафтил уксусная кислота (NAA), индол-3-масляная кислота (IBA), и 2,4-дихлорфенокси уксусная кислота (2,4-D) [12, 13]. В ряде работ была выявлена географически обусловленная потребность в определенных регуляторах роста. Так, например, индукция каллусообразования у трех экотипов родиолы розовой из южного Урала и Алтая (РФ) определялась БАП и ИУК, концентрация которых варьировала в пределах 0,1-0,2 мг/л [12].В других исследованиях у экотипов родиолы Алтайскогоэкотипа показана потребность в высоких концентрациях БАР (в 10-15 раз выше) в сравнении с эксплантами от тибетского экотипа золотого корня [14].

Резюмируявышесказанное, можно отметить, что определенных требований к условиям культивирования invitroродиолы розовой не имеется, в этой связи необходима разработка собственного протокола микроклонального размножения родиолы розовой, собранной на территории казахстанского Алтая.

В Казахстане исследования по введению родиолы розовой в культуру invitro не проводились, хотя ареал распространения данного вида довольно широкий: значительные популяции родиолы выявлены на Алтае, Восточном Казахстане, а также в предгорьях Алатау. Проводимые исследования были направлены на изучение ареалов распространения и изучения их биологических особенностей [15, 16, 17].

Цель исследования – введение в культуру invitroи микроклональное размножение ценного лекарственного растения родиолырозовой (RhodiolaroseaL.).

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве материала исследований были использованы растения родиолы розовой, собранные в местах ее естественного произрастания на территории казахстанского Алтая.

Маршруты экспедиций охватывали 2 географических района: территорию Южного и Западного (Юго-Западного) Алтая. Общее руководство экспедициями и разработкамаршрутных исследований осуществлялисьизвестным ботаником, кандидатом биологических наук Котуховым Ю.А. Координаты и абсолютная высота местонахождения ценопопуляции, из которой был взят материал живых растений для микроклонального размножения, были определены с помощьюGPS-навигатора. При определении видового состава растений, образующих фитоценоз с участием родиолы розовой, использованы фундаментальные сводки «Флора Казахстана» [18] и «Флора Сибири»[19]. Численность и проективное покрытие определяли методом пробных площадок размером 0,25-1м2.

Введение в культуру invitro проводили в лабораторных условиях после поверхностной стерилизации в различных агентах – гипохлорите натрия, этаноле, марганцовокислом калие, сулеме. В качестве эксплантов были использованы листья, стебли, пазушные и корневищные почки, апексы стеблей.

Изолированные от донорных растений корневищные почки, апексы стеблейпосле поверхностной стерилизации помещали на питательные среды, содержащие фитогормоны – БАП, НУК, ИУК, зеатин в различных концентрациях, которые подбирались эмпирически. Помимо экзогенных фитогормонов, в состав питательных сред входили: сахароза (30 г/л), агар (5-7 г/л). Значение рН всех питательных сред составляло 5,7-5,8. Питательные среды стерилизовались автоклавированием при 121ºС в течение 20 мин [20].

Культивирование корнесобственных регенерантовродиолы проводили в сосудах с почвой, торфом и перлитом (по отдельности или в комбинации). Температурно-влажностный режим культивирования регенерантовродиолы в почвогрунте был аналогичным культуре invitro.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сбор донорных растений родиолырозовой (RhodiolaroseaL.)

В процессе скрининговых исследований на хребтах Казахстанского Алтая в зависимости от местообитаний и увлажнения почвы было выделено несколько групп ценопопуляцийродиолы розовой. Наиболее мощное развитие популяции родиолырозовой имеют в условиях благоприятного водно-температурного режима, на почвах с высоким содержанием гумуса в почве, что обуславливает пышное развитие растительности. С продвижением вглубь лесного пояса встречается все реже и постоянновыпадает из состава фитоценозов. Анализ за состоянием развития родиолырозовой в верхнем пределе ее распространения (2100-2300 м над ур.м.) дают основания считать эти местообитания экстремальными.

В результате экспедиционных исследований был проведен сбор исходного материала родиолы розовой для введения в культуру invitro: в качестве доноров использовали растения родиолы розовой из популяции, расположенной на территории Западного Алтая (хр. Ивановский, вершина Вышеивановская верховья р. Татарка,около снежников). Географические координаты популяции N 50°18´58", E 83°52´12" (высота 1940 м над ур. м.) (рис. 1).

Рис.1.Растение родиолы розовой в фазу цветения(Западный Алтай, хр. Ивановский,верховьяр. Татарка, 1940 м над ур.м.
Fig.1.The plant of Rhodiola rosea in the flowering stage(Western Altai, m. Ivanovsky,r. Tatarka, 1940 m above sea level)
 
Рис.1.Растение родиолы розовой в фазу цветения(Западный Алтай, хр. Ивановский,верховьяр. Татарка, 1940 м над ур.м.
Fig.1.The plant of Rhodiola rosea in the flowering stage(Western Altai, m. Ivanovsky,r. Tatarka, 1940 m above sea level)

 

Протокол стерилизации эксплантов родиолы розовой

Данный этап в технологии культивирования тканей является первоначальным и довольно проблематичным, поскольку важно сохранить жизнеспособность эксплантов при соблюдении их стерильности. Для индукции культуры in vitro родиолы розовой использовали различного типа экспланты: верхушки побегов, пазушные и корневищные почки, листья, стебли, зрелые листья, корни, стебли. Получение асептических культур из растений, взятых из природных популяций, всегда являлось довольно большой проблемой ввиду наличия скрытой инфекции. Для этого большинство исследователей рекомендуют использовать многоступенчатые протокола стерилизации, включающие обработку несколькими антисептиками. Ввиду широкой специфичности действия используемых веществ многоступенчатые протокола могут быть универсальными для стерилизации эксплантов различной органной принадлежности [21, 11].

Предварительно все экспланты были тщательно очищены от остатков земли, затем промыты под струей проточной воды в течение нескольких часов. На первом этапе введения в культуру invitro нами были отработаны различные протокола стерилизации, включающие использование этилового спирта, гипохлорита натрия, марганцовокислого калия, перекиси водорода в различных концентрациях. Протокол №1 предусматривал следующие агенты: этанол 70% – 3 мин, хлорамин 20%– 15 мин. Протокол №2: этанол 70%– 3 мин, перекись водорода 3%– 5 мин; протокол №3: этанол 70%– 5 мин, хлорамин 20% – 15 мин, сулема 0,1% – 10 мин; протокол №4: этанол 70% – 3 мин, сулема 0,1% – 20 мин; протокол №5: этанол 70% – 3 мин, сулема 0,1% – 30 мин; протокол №6: этанол 70% – 3 мин, сулема 0,1% – 40 мин; протокол №7: перманганат калия 0,01% – 15 мин, сулема 0,1% – 10 мин; протокол №8: перманганат калия 0,01% – 5 мин, перекись водорода 3% – 5 мин, сулема 0,1% – 15 мин. После экспозиции в стерилизующих агентах проводили 3-кратную отмывку в стерильной воде в течение 15 мин. Эффективность протокола стерилизации определяли по количеству инфицированных эксплантов на 7 день культивирования, а также по показателям жизнеспособности эксплантов.

Исследования выявили зависимость степени инфицированности различных эксплантов от протокола стерилизации. Так, например, стеблевые экспланты были значительно менее инфицированы, наблюдали полное отсутствиеинфекции в сравнении с другими эксплантами. Наиболее сложным был процесс стерилизации корневищных почек, ввиду наличия инфекции в латентной форме. Для этих эксплантов эффективными оказались протокола, предусматривающие использование 2-3 агентов, несмотря на то, что многоступенчатаястерилизация с использованием перманганата, сулемы снижает количество жизнеспособных эксплантов.

Стерилизацию семян родиолы проводили после предварительной стратификации в растворах гибберелловой кислоты (GA3) и тиомочевины, последняя, помимо ростостимулирующего действия, обладает еще и фунгицидной активностью. По данным ряда исследователей, тиомочевина в оптимальной ростостимулирующей дозе 0,1 мас.% увеличивает энергию прорастания семян, длину побегов и корней проростков, а также их массуна 18-30% [22, 23]. В наших исследованиях по стерилизации семян родиолы была показана эффективность 0,1% раствора сулемы при времени экспозиции не менее 30 мин.

Таким образом, выявлена различная специфика стерилизации различных эксплантовродиолы розовой: для стеблевых эксплантов эффективно использование 70% этанола и 0,1% сулемы (15 минут) для сохранения жизнеспособности стерильных культур. Богатые меристематическими тканями корневищные и стеблевые апексы нуждаются в более длительном экспонировании в 20% растворе хлорамина, жизнеспособность эксплантов составляет 67%. Для введения в культуру in vitro листовых эксплантов растений родиолы требуется многоступенчатый протокол с использованием нескольких стерилизующих агентов.

 

Выбор типа эксплантов родиолы розовой для культуры in vitro

Данный этап исследований также является критическим, поскольку должен обеспечить эффективный рост культуры тканей в условиях in vitro, потенциал органогенеза и даже генетическую стабильность микроклонов. При выборе эксплантов ученые исследуют влияние различных факторов, таких как тканевая специфичность, возраст донорного растения, физиологический статус экспланта. Однако анализ научной литературы показывает, что наиболее распространен эмпирический подход при проведении экспериментов по выявлению факторов, инициирующих пролиферацию клеток в условиях invitro. Для инициации роста культур родиолы розовой в условиях invitroнами было использовано несколько типов эксплантов: верхушечные почки (10-12 мм), листовые узлы с двумя соседними листьями, сегменты стволовые (8-10 мм), корневище почки (10-12 мм), семядольные листья.

В данной серии экспериментов нами использовались несколько вариантов питательных сред, на основе среды Мурасиге и Скуга с добавлением экзогенных фитогормонов в различных концентрацияхдля индукции органогенеза in vitro. Реакция различных типов эксплантов родиолы зависела от типа и концентрации используемых фитогормонов. Образование каллусной ткани было инициировано только при использовании листовых эксплантов, при этом наиболее высокие показатели наблюдали при использовании 2,4-Д и бензиламинопурина-6 (таблица 1).

На стеблевых эксплантах при культивировании в присутствии НУК и зеатина отмечали индукцию каллусогенеза менее чем у 10% эксплантов, основная часть эксплантов была некротизирована. Наиболее эффективным является использование в качестве эксплантов апексов побегов и проростков, которые при культивировании на индукционных средах, содержащих цитокинины и ауксины в соотношении 10:1, активно пролиферировали с образованием почечных конгломератов (рис. 2).

 

Таблица 1. Выбор типа экспланта для микроклонального размножения родиолы розовой (через 30 дней культивирования)
Table 1. Select the type of explant for micropropagation of Rhodiola rosea (after 30 days of culture)

 

Тип экспланта

 

Type of explant

Эффективнаякомбинацияфитогормонов

 

Effective combination of phytohormones

Частотановообразований, %

 

The frequency of growths, %

Реакция эксплантов

 

Reaction explants

Апексы стеблей и проростков

 

Apexes of stems and seedlings

NAA–0,2мг/л

BAP – 2мг/л

75-80%

 

Активация роста, удлинение междоузлий

IAA–0,2 мг/л

BAP – 2 мг/л

65-90%

Активация роста, формирование листовой розетки

Листья, семядольные экспланты

 

Leaves, cotyledonary explants

2,4-D–0,5мг/л

BAP – 2 мг/л

10-30%

Индукциякаллусов

Сегментыстеблей

 

Segments of the stem

NAA–0,2 мг/л

Зеатин – 2 мг/л

Менее 10%

 

Отсутствие роста, частичный некроз, индукция каллусогенеза

 у основания стебля

Корневищныепочки

 

Rhizomatous  buds

NAA–0,2 мг/л

Зеатин – 2 мг/л

25-30%

Активация роста почек

IAA–0,2 мг/л

Зеатин – 2 мг/л

30-40%

Индукция стеблеобразования

 

Аналогичные результаты получены и у других исследователей. Так, Ишмуратова М.М. экспериментально показала, что в качестве эксплантов родиолы могут быть использованы только семена и почки смешанного типа, поскольку использование только генеративных почек приводит к формированию измененных по габитусу ассимиляционных побегов и листьев [24].

 

 

 

 

Рис.2. Индукция адвентивного органогенеза из апексов родиолы розовой
Fig.2.The induction of adventitious organogenesis from the apexes of Rhodiola rosea

 

 

 

Рис.2. Индукция адвентивного органогенеза из апексов родиолы розовой
Fig.2.The induction of adventitious organogenesis from the apexes of Rhodiola rosea

 

 

 

По мнению [10], низкая активность пролиферации стеблевых сегментов не позволяет использовать их в качестве эксплантов при культивировании in vitro. В то же время апексы стеблей и листья вследствие высокой тотипотентности, достигающей 80% в присутствии зеатина, могут быть использованы для получения каллусных культур [21].

 

Наши эксперименты показали, что на апикальных эксплантах формирование конгломерата наблюдали и в отсутствии экзогенных регуляторов роста. Однако на безгормональной среде почечные конгломераты быстро теряли свою жизнеспособность, сформированные побеги были очень короткими, плотно расположенными. Побеги второго уровня не успевали сформировать достаточной длины стебель, часть вновь возникающих адвентивных почек была некротизирована вследствие нарушения гормональной регуляции процессов морфогенеза.На наш взгляд, именно повышенное содержание фитогормонов с цитокининовой активностью в сочетании с гибберелловой кислотойприводит к интенсивному адвентивному побегообразованию, хотя в ряде экспериментов показано, что повышенное содержание цитокининов, в частности BAP (бензиламинопурина), приводит к формированию вытянутых ассимиляционных побегов с редуцированными листовыми пластинами [24].

 

 

 

Микроклональное размножение родиолы розовой

 

Наиболее успешные экспериментальные исследования по микроклональному размножению родиолы розовой дикого экотипа проведены в Болгарии, где была разработана целая система по получению каллусных культур, индукции органогенеза, микроклонирования и реинтродукции этого ценного растения в естественных местах обитания.Изучение различных типов эксплантов, индукционных сред и комбинаций фитогормонов показало, что апексы стеблей и проростков являются наиболее оптимальными эксплантами для микроклонального размножения [11, 25].На эффективность микроклонированияродиолы оказывают влияние различные факторы, в т.ч. и время года. Так, максимальный коэффициент размножения наблюдали в мае-июне – 6,78, в холодное время года формировалось до 2,11 побегов на эксплант [12, 24]. Это были первые эксперименты с культивированием диких растений, и полученные регенерантыбыли успешно адаптированы к естественным высокогорным условиям обитания. Растения регенеранты родиолы розовой 2-3 года вегетации по данным фитохимического анализа содержали салидрозид, розавин, розацин и розарин, что подтверждает потенциал биотехнологических методов для сохранения и возобновления природных популяций лекарственных видов, находящихся под угрозой исчезновения [25, 26].

 

Однако большинство научных исследований показало, что доминирующую роль в регуляции процессов морфогенеза invitro играют регуляторы роста. Как известно, биосинтез экзогенных фитогормонов зависит от тканевой принадлежности эксплантов: в апексах побегов образуются гормоны ауксинового ряда (ИУК), мезофильные ткани листьев являются донором ключевого продукта синтеза гиббереллинов – каурена, а также абсцизовой кислоты. В апексах корней синтезируется кинетин [22]. Учитывая этот факт, возможно подобрать оптимальную технологию клонирования определенных типов эксплантов. В наших исследованиях в качестве дополнительного источника цитокининовзеатин и БАП (бензиламинопурин) в сочетании с гибберелловой кислотой, которая также участвует в синтезе цитокининов [26, 27]. Максимальное количество адвентивных побегов (до 34 на эксплант) было зафиксировано при субкультивировании на среде МСZ1, содержащей 2 мг/л зеатина,0,1 мг/л ИУК и 0,5 мг/л гибберелловой кислоты. На наш взгляд, именно двухэтапное культивирование эксплантов на среде с зеатином значительно повышает меристематическую активность почечных конгломератов, что позволяет увеличить рост побегов второго уровня и, тем самым, повысить коэффициент размножения (таблица 2, рисунок 2).

 

 

 

Таблица 2.Субкультивирование апикальных меристем родиолы розовой
Table 2.Subculturing of the apical meristem of Rhodiola rosea

 

Среда субкультивирования*

 

Mediasubculture*

Количествомеристем

 

No. of meristems, pcs.

Интенсивность органогенеза, %

 

Intensity

organogenesis, %

Количество стеблей второго уровня, шт.

 

No. of shoots the second level,pcs.

Длина стебля, см

 

Shootlength, cm

МCZ– МCZ1

34

88,3

20-34

0,5-4,5

МCZ–МСО

38

36,8

2-4

1,5-2,5

MCZ–МСIM

32

56,3

2-6

1,5-2,5

МСIM–МСIM-MCZ1

32

81,3

4-6

0,5-1,0

МСIM– MCО

32

37,5

2-6

2,0-5,5

МСО–МСO

36

66,7

10-18

0,5-2,5

MCО– MCZ–МСIM

26

24,3

4-8

0,5-2,5

MCО–MCZ1

24

41,7

2-4

1,5-2,2

*Состав среды: MSZ1 –зеатин2 мг/л,IAA 0,1 мг/л, GA3 0,5 мг/л;

МСО –GA3 0,5 мг/л; МСIM–BAP4 мг/л, IAA 0,1 мг/л

 

 

 

 

 

 

Рис.2. Индукция вторичного побегообразования и микроклональное размножение родиолы розовой
Fig.2. Induction of auxiliary shoot and  shoot multiplication of Rhodiola rosea

 

 

 

Рис.2. Индукция вторичного побегообразования и микроклональное размножение родиолы розовой
Fig.2. Induction of auxiliary shoot and  shoot multiplication of Rhodiola rosea

 

 

 

В последующем регенерантные побеги длиной 2,5-4 см отсекались и помещались на среду для индукции ризогенеза, интенсивность которого зависела от комбинации регуляторов роста и плотности среды. Высокие значения формирования корневой системы у регенерантных побегов родиолы наблюдали при концентрации агара от 4 до 6%, однако морфометрические показатели регенерантов родиолы (количество и длина корней, длина побегов и количество междоузлий) были выше на средах, содержащих 0,6% агара.

 

После формирования корневой системы на безгормональной среде МС, содержащей половинную норму солей, регенеранты высаживались в сосуды с почвогрунтом для адаптации (рис. 3).

 

 

 

 

 

 

Рис.3.Адаптация растений родиолы розовой в сосудах с почвогрунтом
Fig.3.Adapting plant Rhodiola rosea in vessels with soils

 

 

 

Рис.3.Адаптация растений родиолы розовой в сосудах с почвогрунтом
Fig.3.Adapting plant Rhodiola rosea in vessels with soils

 

 

 

Адаптационные характеристики регенерантов родиолы определялись прежде всего состоянием развития побегов и составом почвогрунта. Наиболее высокие покзатели выживаемости наблюдали при использовании регенерантов, полученных из сегментов почечного конгломерата, которые в сравнении с одиночными регенерантными побегами обладали высокой регенеративной способностью, формируя адвентивные побеги второго порядка. Приживаемость растений регенерантов в почве в зависимости от состава почвогрунта была на уровне 30-70%.

 

Таким образом, нами были оптимизированы отдельные этапы культивирования in vitro родиолы розовой – стерилизация, культивирование и индукция органогенеза, а также адаптация регенерантов к культивированию в условиях почвогрунта. Разработанный протокол микроклонального размножения родиолы розовой казахстанских экотипов состоит из получения стерильных проростков на среде ½ МС, изоляции меристем у 14-дневных стерильных проростков, культивирование меристем на среде МС+2 мг/л зеатина и 0,2 мг/л ИУК в течение 6 недель, субкультивирование на аналогичной среде в течение 6 недель для увеличения коэффициента побегообразования, культивирование адвентивных регенерантных побегов на среде с половинной концентрацией минеральных солей и 0,6% агара, высадка корнесобственных регенерантов в почву.

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Вопросы сохранения биоразнообразия природной флоры становятся с каждым годом все более актуальными, это обусловливает необходимость разработки национальной стратегии сохранения и возобновления природных популяций лекарственных растений. Родиоларозовая или золотой корень являются ценным лекарственным растением, популяции которого значительно сокращаются вследствие неконтролируемых сборов населением. В этой связи для возобновления природных популяций важную роль играют методы биотехнологии, в частности, микроклональное размножение, позволяющие размножить invitro растительный материал и наработать основу для создания промышленных плантаций exsituэтого ценного лекарственного растения, находящегося под угрозой исчезновения. Полученные растения-регенерантыinvitro можно использовать как исходный материал для интродукции и реинтродукции.Разработка технологии микроклонального размножения родиолы розовой с перспективой дальнейшей реинтродукциипозволит сохранить генетическое разнообразие вида.

 

 

 

Финансирование

 

Исследования выполнены при поддержке Министерства образования и науки Республики Казахстан по проекту «Разработка технологии микроклонального размножения родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) с целью получения сырья для создания лекарственных препаратов», выполняемому в рамках НТП «Промышленные биотехнологии» на 2014-2016 гг

 

 

 

REFERENCES

 

  1. OhranaokruzhajushhejsredyiustojchivoerazvitieKazahstana/Statisticheskijsbornik [Environmental protection and sustainable development in Kazakhstan / Statistical Yearbook.Agency of Statistics of RK]. Agentstvo o statistike RK, Astana, 2008, 269 p.
  2. Krajewska-PatanА. Chemical investigations of biotransformedRhodiolarosea callus tissue. Herbapolonica, 2007, vol. 53, pp. 77-87.
  3. Canter P.H., Thomas H., Ernst E. Bringing medicinal plants into cultivation: opportunities and challenges for biotechnology. Trends in biotechnology, 2005, vol. 23, no. 4, pp.180-185.
    CrossRef
  4. Reed B., Sarasan M., Kane V. Biodiversity conservation and conservation biotechnology tools. In vitro cell developmental biology plant, 2011, no. 47, pp. 1-4. D
    CrossRef
  5. Tripathi L., Tripathi J.N. Role of biotechnology in medicinal plants. Tropical journal of pharmaceutical research, 2003, vol. 2, no. 2, pp.243-253.
  6. Edison S., Unnikrishnan M., Vimala B., Santha V. Biodiversity of tropical tuber crops in India. NBA Scientific Bulletin, 2006, no. 7, p.60.
  7. Grech-Baran M., Sykłowska-Baranek K.,Pietrosiuk A. Biotechnological approaches to enhance salidroside, rosin and its derivatives production in selected Rhodiola spp. in vitro cultures. Phytochemistry reviews, 2015, no. 14, pp. 657-674.
    CrossRef
  8. Kirichenko E.V., Rudenko S.S., Baglaj B.M., Masikevich U.G. Leaf culture from in vitro propagated Rhodiolarosea.  Bulletin GBS, 1994, no. 169, pp. 50-54.
  9. Hai-jun L., Bin G., Qiong Y. et al. Tissue culture of four Rhodiola species. Acta Botanica Boreali-OccidentaliaSinica, 2006, pp. 207-210.
  10. Tasheva K., Kosturkova G. Bulgarian golden root in vitro cultures for micropropagation and reintroduction. Central European Journal of Biology,2010, vol. 5, no. 6, pp. 853-863.
    CrossRef
  11. Tasheva K., Kosturkova G. Establishment of callus cultures of Rhodiolarosea Bulgarian ecotype.ActaHorticulare, 2012, vol. 955, pp.129-136.
    CrossRef
  12. Ishmuratova M.M. Clonal micropropagation of Rhodiolarosea L. and R. iremelicaBoriss. in vitro. Plant resources, 1998, vol. 34, pp. 12-23.
  13. Martin J. In vitro culture establishment of Schizandrachinensis (turz.) Baill. andRhodiolaroseaL., two adaptogenic compounds producing plants. Journal of Phytology, 2010, no. 2 (11), pp. 80-87.
  14. Yin W.B., Li W., Du G.S., Huang Q.N. Studies on tissue culture of Tibetan Rhodiolarosea. Acta Botanica Boreali-OccidentaliaSinica, 2004, vol. 24, pp. 1506-1510.
  15. Ivashhenko A.A., KotuhovJu.A. O redkihvidahlekarstvennyhrastenijZapadno-Altajskogozapovednika // Botanicheskoeresursovedenie: dostizhenijaiperspektivyrazvitija [Rare species of medicinal plants of the West Altay reserve/ Botanical Resources study: achievements and prospects], 2000, pp. 27-28.
  16. KotuhovJu.A., Ivashhenko A.A., LajmanDzh. Flora sosudistyhrastenijZapadno-Altajskogozapovednika [Flora of vascular plants of the West Altay reserve]. Almaty: Tethys, 2002,108 p.
  17. Ajdarbaeva D.K., Kuz'minJe.V., Gemedzhieva N.G. ResursnoemnogoobrazielekarstvennojfloryhrebtaJuzhnyjAltaj [Resource diversity of medicinal flora mountain range Southern Altai] // Mater. nauch. konf. “ProblemyobespechenijabiologicheskojbezopasnostiKazahstana” [Proc. conf. “Problems of maintenance of biological safety in Kazakhstan”]. Almaty, 2008, pp. 82-85.
  18. Flora Kazahstana[Flora of Kazakhstan]. Alma-Ata, AN SSR, 1958-1966, vol.1-9.
  19. Flora Sibiri[Flora Siberia]. Novosibirsk,Nauka, 1990, vol. 1-14.
  20. Sarasan V., Kite G., Sileshi C. Applications of phytochemical and in vitro techniques for reducing over-harvesting of medicinal and pesticidal plants and generating income for the rural poor. Plant Cell Report, 2011, no. 30, pp. 1163-1172.
    CrossRef
  21. Liu H.J., Xu Y., Liu Y.J., Liu C.Z. Plant regeneration from leaf explants of Rhodiolafastigiata. In vitro cellular and developmental biology. Plant, 2004, vol. 42, pp. 345-347.
    CrossRef
  22. Romanov G.A., Medvedev S.S. Auksinyicitokininy v razvitiirastenij. Posledniedostizhenija v issledovaniifitogormonov. [Auxins and cytokinins in plant development. Recent advances in the study of plant hormones]. Fiziologijarastenij, 2006, vol. 53, no. 2, pp. 309-319.
  23. Tlehusezh M.A., Tjuhtenjova Z.I., Nen'ko N.I. Aktivatoryprorastanijasemjanozimojpshenicynaosnoveamidovpolizameshhjonnojaminomasljanojkisloty [Activators of germination of winter wheat seeds based amide of a poly-substituted aminobutyric acid]. Sovremennyeproblemynaukiiobrazovanija, 2015, no. 1, pp. 6-13.
  24. Ishmuratova M.M. Biologicheskie I khimicheskieosobennosti, kulturatkaneyRhodiolarosea L. iRhodiolairemelicaBoriss. ivozmozhnostihintriduktsii v Bashkortostan (naprimere g. Ufa). [Biological and chemical characteristics, tissue culture Rhodiolarosea L. and Rhodiolairemelica and the possibility of their introduction into the Bashkortostan (for example, the city of Ufa). Kand. biol.sci.diss.]. Dis. cand.biol.nauk. Ufa, 1996, 20 p.
  25. Tasheva K., Kosturkova G. The role of biotechnology for conservation and biologically active substances production of Rhodiolarosea: endangered medicinal species. The Scientific World Journal, 2012, vol. 3, 13 p.
    CrossRef
  26. György Z., Tolonen A., Pakonen M. et al.  Enhancing the production of cinnamyl glycosides in compact callus aggregate cultures of Rhodiolarosea by biotransformation of cinnamyl alcohol. Plant Science, 2004, vol. 166, no. 1, pp. 229-236.
    CrossRef
  27. Butenko R.G. Biologijakletokvysshihrastenij in vitro ibiotehnologiinaihosnove [Biology of cells of higher plants in vitro and Biotechnology based on their]. M., FBK-PRESS, 1999, 160 p.

 

 

 

IN VITRO ҚЫЗҒЫЛТ СЕМІЗОТТЫҢ КУЛЬТУРАСЫ (RHODIOLA ROSEA L.)

 

 

 

Хапилина О.Н., Купешев Ж.С., Данилова А.Н., Календарь Р.Н.
Ұлттық биотехнология орталығы
Қорғалжын тас жолы, 13/5, Астана, 010000, Қазақстан

 

 

ТҮЙІН

 

Мақалада қызғылт семізотты (Rhodiola rosea L.) in vitro культурасына енгізу жөнінен зерттеу жұмыстары көрсетілген. Зерттеу нысаны ретінде қазақстандық Алтай аумағында табиғи жағдайда өсетін қызғылт семізоттың өсімдіктері пайдаланылды. Зерттеу жұмыстарын орындау барысында in vitro культурасына құнды дәрілік өсімдік - қызғылт семізотты енгізу жөнінен тәжірибелер жүргізілді. Семізоттың әртүрлі экспланттар үлгілерін зарасыздандырудың тиімді хаттамалары анықталды. Семізоттың асептикалық культураларын алу үшін антисептиктердің әртүрлі типтерін пайдалану арқылы зарасыздандырудың көп кезеңді  хаттамаларын пайдалану қажет екендігі анықталды. Зерттеу нәтижесінде экспланттардың ең тиімді типтері өркендер апексі мен семізоттың тамырсабақтық бүршіктері болатыны көрсетілді. Экзогенді цитокининдердің жоғарғы концентрациялары кезінде адвентивті өркендердің индукциясы болады. Адвентивті өркендердің неғұрлым көп саны құрамында 2 мг/л зеатин, 0,1 мг/л ИСҚ и 0,5 мг/л гибберелл қышқылы бар МСZ1 ортасына субкультивтендіру кезінде (эксплантқа 34 -ке дейін) болды.  Регенеранттардың тамыр түзу қабілеттілігі қоректік ортадаға агардың концентрациясына байланысты. Қоректік ортада  0,6% агар болған кезде семізот регенеранттарының морфометрикалық сипаттамалары ең жоғары болды.

 

Негізгі сөздер: алтын тамыр, қызғылт семізот, Rhodiola roseaL., in vitro культурасы, экспланттар, адвентивті органогенез, микроклональды көбею