ABSTRACT

Determining the genetic stability of the causative agent of anthrax requires analysis of highly variable regions of DNA, including tandem repeats. Analysis of 25 loci with tandem repeats (MLVA-25) is a highly discriminating method used to genotype field strains of Bacillus anthracis, and allows the geographical distribution of genotypes to be tracked. This method can be easily applied to control the genetic stability of vaccine strains and strain identification. However, to date, there is no data about the genotypes of MLVA-25 vaccine strains used for vaccination in countries of the Commonwealth of Independent States. Here, using MLVA-25, we genotyped vaccine strains of B. anthracis STI-1 and B. anthracis 55-VNIIVViM that were deposited by three individuals from Kazakhstan. MLVA profiles of the individual vaccine strains obtained were identical, irrespective of the source. B.anthracis STI-1 and B. anthracis 55-VNIIVViM differed only in a single tandem repeat at the pXO1aat locus. Comparison of MLVA profiles obtained in this study with those obtained by in silico analysis of whole genome data revealed a discrepancy at the Bam22 and Bam23 loci in both B. anthracis STI-1 and B. anthracis 55-VNIIVViM, and at the Bam5 and Bam24 loci of B. anthracis STI-1.This study shows that MLVA analysis is highly discriminatory and can be used for quality control analysis of vaccine preparations. Moreover, standardization of the procedure for commercial application would require the analysis of typical crops.

Keywords: Bacillus anthracis, MLVA typing, VNTR alleles, vaccine strains, anthrax.

---

575.22:577.29

 

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ОДНОРОДНОСТИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ  BACILLUS ANTHRACIS СТИ-1 И  B. ANTHRACIS 55 ВНИИВВИМ МЕТОДОМ MLVA- 25

 

 

АБСТРАКТ

Высокая генетическая стабильность генома возбудителя сибирской язвы требует использование протоколов на высоковариабельных участках ДНК. Тандемные повторы относятся к гипервариабельной ДНК. Анализ 25 локусов с тандемными повторами (MLVA-25) зарекомендовал себя как высоко дискриминационный метод генотипирования полевых штаммов Bacillus anthracis, позволяя отслеживать географическое распределение генотипов. Метод может быть легко интерполирован в контроль генетической стабильности вакцинных штаммов и штаммовой идентификации. Однако до настоящего времени нет данных по генотипам MLVA-25 вакцинных штаммов, используемых для вакцинации в странах СНГ. В данной статье представлены результаты генотипирования вакцинных штаммов Bacillus anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55 ВНИИВВиМ, депонированные тремя депозиторами Казахстана с использованием MLVA-25. MLVA профили вакцинных штаммов трех различных депозиторов были идентичны между собой.  Bacillus anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55 ВНИИВВиМ различались между собой только в локусе pXO1aat на 1 тандемный повтор. Сравнение MLVA профилей Bacillus anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55 ВНИИВВиМ, полученных в данном исследовании с MLVA профилями, полученных методом in silico на основании полногеномных данных, выявили несоответствие значений в локусах Bam22, Bam23, кроме того локусы Bam5 и Bam24 у Bacillus anthracis СТИ-1. Исследование показало, что MLVA анализ является высокодискриминационным методом и может быть использован в контроле качества вакцинных препаратов. Для стандартизации процедуры требуется анализ типовых культур. 

Ключевые слова: Bacillus anthracis, MLVA типирование, VNTR аллели, вакцинные штаммы, сибирская язва.

---

ВВЕДЕНИЕ

Bacillus anthracis–грамположительная, спорообразующая бактерия, является возбудителем зоонозного заболевания – сибирская язва, которая эндемична во всем мире, за исключением Антарктиды. Сибирской язвой преимущественно болеют травоядные домашние животные, в основном поражается крупный и мелкий рогатый скот [1], заболевание остальных видов животных регистрируется реже. Хладнокровные амфибии и рептилии после искусственного поднятия температуры могут быть экспериментально заражены [2]. Случаи заражения людей не часты и обычнообусловлены контактами с зараженными животными или продукцией животноводства. В зависимости от пути заражения различают: легочную или ингаляционную, желудочно-кишечную и кожную формы. Отсутствие соответствующей терапии может привести к гибели, особенно при легочных формах заболевания. Главная особенность возбудителя сибирской язвы – спорообразование, споры могут выживать на открытом воздухе в течение десятилетий, что повышает их жизнеспособность и патогенность. Выживаемость спор и возможность их аэрозолирования теоретически долгое время ставили Bacillus anthracis в верху рейтинга патогенов, имеющих потенциал использования в бактериологическом оружии. Беспрецедентные биотеррористические атаки подтвердили реальность теоретических предположений и катастрофичность биотерроризма для человечества [3].

Первые исследования сибирской язвы принадлежат Роберту Коху, который в 1876 году впервые доказал бактериальное происхождение заболевания, выделив чистую культуру Bacillus anthracis. Выделение чистой культуры спровоцировали работы по созданию вакцин на основе аттенуации патогенных штаммов, которая основана на потереплазмид или на мутациях в самом геноме бациллы. Геном Bacillus anthracis представлен циркулярной хромосомой молекулярной массой около 5,23 млн.п.н. и двух плазмид pXO1 и pXO2 с молекулярной массой 181,6 тысяч п.н. 96,2 тысяч п.н. соответственно. Плазмида pXO1 кодирует трехсторонний сибиреязвенный токсин, состоящий из защитного антигена, летального фактора и фактора отека, тогда как плазмида pXO2 содержит гены, вовлеченные в капсулообразование [4].

В 1881 году Луи Пастер создал первые в мире противосибиреязвенные вакцины путем аттенуации изначально вирулентного штамма, получившие название I и II вакцины Пастера, которые имели различную степень ослабления. Опыт использования показал, что вакцины Пастера имеют высокую реактогенность и смертность привитых животных, превышающую3%. Впоследствии разные ученные предпринимали попытки дальнейшей аттенуации возбудителя и получения новых, более эффективных и менее опасных вакцин. Так были получены вакцины Ценковского в 1883 году с генотипом (pXO1+/pXO 2+), вакцины Ланге в 1891 году, которые долгое время применялись на территории Российской империи и, впоследствии, СССР. Для них характерно снижение реактогенности в сравнении с вакцинами Пастера. Также описаны живые вакцины, которые имеют обе плазмиды, но могут быть ослаблены хромосомными мутациями, некоторые штаммы Пастера, итальянский Карбосап-вакцинный штамм [5], аргентинский штамм A [6].

Большинство живых вакцин против сибирской язвы для животных, рекомендованных МЭБ, используемые во всем мире,в настоящее время основаны на бескапсульномиммуногенном штамме 34F2 B. аnthracis (PXO1+/pXO2-), полученном из вирулентного бычьего изолята в 1937 году в США, имеющем высокую иммуногенность и безвредность.

В Советском Союзе первый безкапсульный штамм был выделен в 1940 году методом аттенуации вирулентного штамма «Красная Нива», изолированного от лошади. Данный штамм имеет аналогичный генотип со штаммом 34F2 (рXO1+/pXO2-). Для массовой вакцинации животных штамм начали применять с 1942 года и использовали на протяжении более 40 лет. Со временем было установлено снижение иммуногенности данного штамма, при которой возникла необходимость ежегодно двукратно вакцинировать животных, что, возможно, было связано с диссоциацией штамма СТИ. В 1983-1986 гг. во ВНИИВВиМ была создана и апробирована вакцина на основе штамма B. аnthracis №55, представляющая собой природно-ослабленный бескапсульный штамм, который однороден и обладает сниженной, в сравнении со штаммом B. аnthracis СТИ-1, реактогенностью, но при этом создает стойкий иммунитет на 18 месяцев[7]. Вакцины на основе штамма B. аnthracis№55 и в настоящее время используются для поголовной вакцинации животных на всей территории Российской Федерации и ряда стран СНГ.

Вакцинации людей проводятв редких случаях и рассматривают ее в качестве средства индивидуальных защиты. Существует два основных типа вакцин против сибирской язвы для человека, рекомендованных ВОЗ (Всемирной Организацией Здравоохранения). Это– AVA (Anthrax Vaccine Adsorbed) иАVP (Anthrax Vaccine Precipitated).AVA (адсорбированная вакцина против сибирской язвы) торговое название BioThrax– это единственная лицензированная FDA вакцина против сибирской язвы человека в Соединенных Штатах. AVA классифицируется как субъединичная вакцина, которая не содержит цельных или живых клеток сибирской язвы. Антигенные (иммунологически активные) порции получают из культуральных фильтров токсигенного, но авирулентного, некапсулированного мутанта, известного как V770-NP1-R штамма Vollum B. anthracis. Существует также аналогичная британская вакцина против сибирской язвы (известная как AVP). В AVA отсутствует капсульная плазмида pXO2 (требующая для полной вирулентности) и состоит главным образом из протективного антигена (РА)[8] с небольшим количеством эдематогенного фактора (EF) и летального фактора (LF), количество которых может варьировать от партии к партии. Также присутствуют другие, нехарактеризованные бактериальные побочные продукты. AVA имеет меньшее количество EF и LF, чем AVP. Данные виды вакцин не одобрены для широкого использования, поскольку они никогда не были всесторонне проверены в ходе испытаний на людях. Вакцину применяют людям, которые, вероятно, контактируют с сибирской язвой в связи с их родом деятельности, например, работники кожевенного завода или военнослужащие. Однако в Советском Союзе и в Китае для вакцинации людей использовали живые вакцины. В бывшем СССР использовали вакцину на основе штамма B. аnthracisСТИ-1, коэффициент эффективности которой составил 75-84,2%, среди населения юга Европы и Среднеазиатских республик [9].

Качество вакцинных препаратов – основа эпидемиологического и эпизоотологического благополучия страны. По информации МИА «Казинформ» со ссылкой на первого вице-министра сельского хозяйства Кайрата Айтуганова, причиной вспышек сибирской язвы в Казахстане в 2016 годубыло низкое качествоиспользованных вакцин [10]. В этой связи, применение многокомпонентного подхода в контроле вакцинных препаратов может минимизировать риск недоброкачественных партий, а оценка генетической стабильности использованных при производстве штаммов, является одним из важнейших элементов, гарантирующих качество препаратов.

Основными характеристиками безопасности вакцин являются: полная инактивация токсинов, отсутствие остаточной вирулентности (или реверсии вирулентности), отсутствие контаминации, генетическая стабильность и генетическая гомогенность. Наибольшей дискриминационной способностью и воспроизводимостью в отношении B. anthracis обладают методы, основанные на анализе ДНК. ДНК анализ успешно применяется в изучении разнообразия изолятов B. anthracis, циркулирующих в различных географических регионах. Метод позволяет отследить место происхождения штаммов и дифференцировать естественные и искусственно созданные вспышки [11]. Мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов (MLVA, multiplelocusvariable-number tandem repeats analysis) является основным методом генетической дактилоскопии B. anthracis[12].MLVA типирование основано на амплификации региона с изменяемым количеством тандемных повторов и определением их количества методом электрофореза. В зависимости от длины повтора возможно использовать агарозный, полиакриламидный гели или разделять фрагменты в капиллярном электрофорезе. Изначально,  Keim и др. [13] предложили протокол для молекулярной типизации штаммов B. anthracis, основанный на анализе 8 VNTR (варьирующие по числу тандемные повторы) локусов (MLVA-8), которые были идентифицированы путем ДНК секвенирования вариабельных фрагментов генома(CG3, vrrB1, vrrB2, vrrC1 и vrrC2), вирулентных плазмид(pXO2-at и pXO1-aat) и ранее описанного вариабельного локуса vrrA[14].Методом MLVA8 было генотипировано 426 штаммов B. anthracis, которые классифицировали их на две основные линии (A и B), включающие 89 различных генотипов. Дискриминационная способность предложенного протокола была ограниченна, например, большинству французских и итальянских штаммов были присвоены MLVA-8 генотипы (GT) 1 и 3, которые отличались только одним маркером. По этой причине было увеличено количество маркеров и создана панель MLVA15[15] [16].Панель MLVA15увеличила количество уникальных MLVA генотипов B. anthracisс 89 до 221.

LeFlèche и др. [17] расширили анализ MLVA8,добавив 14 дополнительных маркеров (Bams1, 3, 5, 7,13, 15, 21, 22, 23, 24, 25, 28, 30, 31), что значительно улучшило разрешающую способность анализа. Разделение ДНК фрагментов проводили на стандартных агарозных гелях, что снижала себестоимость, но усложняло интерпретацию результатов.

FlorigioLista и др. предложили более усовершенствованный, быстрый и точный метод генотипирования B. anthracis с применением капиллярного гель-электрофореза [18]. Преимущество данного метода заключается в высокой точности, особенно при анализе коротких повторов. Предложенная система MLVA включает в себя 25 VNTR маркеров, что увеличило дискриминационную способность по сравнению с ранее описанными протоколами. Капиллярное разделение увеличило воспроизводимость результатов, а возможность мультиплексирования упростило процедуру генотипирования. Создание баз данных MLVA профилей различных патогенов позволяет проводить глобальный мониторинг [19].Метод MLVA типирования также использовался и при изучении генетической стабильности вакцинных штаммов. Например, исследования 36 вакцинных штаммов B. melitensis Rev 1, проведенные D. Garcia-Yoldi c соавт., позволили выявить отличия в 4 локусах, при этом изменения в MLVA профилях коррелировали с изменениями в биологических качествах вакцин – образование крупных колоний, что недопустимо при изготовлении вакцин [20]. MLVA анализ зарекомендовал себя в качестве надежного теста оценки генетической стабильности и достоверности происхождения вакцинных штаммов B. abortus 19 и B. abortus RB51 [21].Высокая дискриминационная способность MLVA метода и генетическая стабильность генома Bacillus anthracis, позволяет использовать MLVAв генетической оценке и подтверждении происхождения штаммов сибиреязвенных вакцин. На данный момент в международных базах отсутствует информация по MLVA профилю вакцинных штаммов, используемых в странах СНГ. Поэтому целью данного исследования являлось проведение генотипирования методом MLVA с использованием 25 VNTR локусов вакцинных штаммов, использующихся для вакцинации в странах СНГ и депонированных в РГП на ПХВ "Национальный референтный центр по ветеринарии" КВКиН МСХ РК.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 7 культур: 3 культуры вакцинного штамма BacillusanthracisСТИ-1, трех различных депозиторов; 3 культуры вакцинного штамма Bacillus anthracis55 ВНИИВВиМ трех различных депозиторов и один вирулентный штамм B. anthracis280/6-15-В, выделенный в Жамбылской области в 2015 году от мелкого рогатого скота.

 

Выделение ДНК

Выделение ДНК проводили с применением набора QiagenQIAampDNA MiniKit, согласно инструкций производителя. Учитывая высокую патогенность B. anthracis выделение ДНК было проведено в лаборатории РГП на ПХВ «Национальный референтный центр по ветеринарии» КВКиН МСХ РК имеющий разрешение на работу с возбудителями инфекционных заболеваний 2-4 групп патогенности.

Образцы ДНК проводили через 0,22 мкм фильтры для удаления из раствора живых спор B. anthracis. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрическим методом с использованием фотометра NanoDrop.

 

Идентификация ПЦР

Для видовой идентификации Bacillus anthracis были использованы праймеры, предложенные ранее Ramisse V. с соавт.[22]. Использовались праймеры для амплификации вирулентных генов pag, локализованных на плазмиде pX01, cap на плазмидеpX02 и Ва813 (ген домашнего хозяйства rpoB)в мультиплексной ПЦР. Состав реакционной смеси в 25 мкл: смесь праймеров по 15пмоль каждого за исключением праймеров Ва813- 25 пмоль; ДНК 6нг; 0,25мМ каждого дНТФ; 1-х ПЦР буфер 10X Taq буфер с KCl (Fermentas,100 mMTris-HCl (pH 8.8 при 25°C)•500 mM KCl•0.8% (v/v) Nonidet P40), ионы магния 2,5мМ;5 нМтетраметиламмония хлорида;7%сахарозы; ксиленцианол10 мг/мл; бетаин – до финальной концентрации 0,2М; 2 единицы Taq ДНК полимеразы (Fermentas).Программа ПЦР амплификации включала: длительную денатурацию95°С в течение 3 минут; 30 циклов, 94°С – 30 секунд, 58°С–45 секунд, 72°С – 45 секунд; финальная элонгация 72°С – 5 минут.

 

MLVA типирование

Для молекулярного типирования вакцинных штаммов B. anthracis был использован мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов (MLVA), включающий в себя 25 локусов, предложенных FlorigioLista (2006) [18]. Для амплификации целевых фрагментов использовано 4 мультиплексных ПЦР реакции. Концентрация праймеровв реакции соответствовала рекомендациям Lista. Смесь включала: 0,2 мМ каждого дНТФ; 1-х ПЦР буфер (20mM (NH₄)₂SO₄, 0,01%(v/v) Tween 20 (Fermentas)), ионы магния 2.5 мМ, DMSO–1 мкл, смесь Taq ДНК полимеразы и Pfu ДНК полимеразы в соотношении 1:8 (Fermentas). Программа ПЦР амплификации включала: 96°С в течение 3 минут; 35 циклов 95°С – 20 секунд, 60°С – 30 секунд, 65°С – 2 минуты; финальная элонгация 65°С – 20 минут.После амплификации образцы разводили в 70 раз и 1,5 мкл использовали для капиллярного разделения на автоматическом генетическом анализаторе ABI3730xl (AppliedBiosystems,Tokyo, Japan), с POP 7 и размерным стандартом LIZ 1200. Анализ размеров VNTR повторов проводили с использованием программного обеспечения GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems).

 

Верификация размеров методом прямого секвенирования

Для амплификации 16 локусов и прямого секвенирования использовали ту же последовательность праймеров, что и для фрагментного анализа. Для 6 локусов, размер которых был менее 300 п.н., был проведен подбор новых праймеров (таблица 1).

 

Название праймера   Primer name	Последовательность праймера 5'-3'   PrimerSequence5'-3'
СG3-seq_F	5'-CTAAAAGACTATAGTACATTTGAT-3'
СG3-seq_R	5'- TATTTCTTGACTTAATGCCAAT-3'
vrrB1-seq_F	5'- CTGCTGCTCCACTAATACTA-3'
vrrB1-seq_R	5'-AGGGTTTTCAACATCAGTA-3'
pX01-seq-F	5'-AAATATACAGCCACTTGATAG-3'
pX01-seq-R	5'-ACATGCTGTGGATGATTAT-3'
pX02-seq-F	5'-CATAAATCTGTCGCCAGTTA-3'
vrrB2-seq_R	5'-CCACAACTTCGTGCTGAAATC-3'
vrrB2_F	5'-CACAGGCTATTCTTTATCAAACTCATC-3' (Lista F et al 2006)

 Реакцию секвенирования проводили с применением BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ApplideBiosystems),согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе 3730xl DNA Analyzer (ApplideBiosystems).Нуклеотидные последовательности были анализированы и объединены в общую последовательность в программном обеспечении SeqMan (DNAStar).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация вакцинных штаммов проводилась мультиплексной ПЦР, результаты представлены на рисунке 1. Анализ позволяет получить предварительную информацию о вирулентности, поскольку отсутствие любой плазмиды снижает патогенность штаммов B. anthracis[23]. У всех 6-ти вакцинных штаммов амплицифировались два гена, ген pag плазмиды pXO1 и хромосомный локус Ва813, ген cap на капсульной плазмиде pXO2 не амплифицировался, что соответствует характеристикам штаммов. Плазмиды вирулентности pXO1 содержит гены, кодирующие компоненты токсина сибирской язвы: pag (протективный антиген, PA), lef (летальный фактор, LF) и cya(фактор отечности, EF). Эти факторы содержатся в островке патогенности 44,8 кб (PAI). Летальный токсин представляет собой комбинацию PA с LF, а фактор отечности представляет собой комбинацию PA с EF[24]. У вирулентного штамма B. anthracis280/6-15-В амплифицировались все три гена.

 

Включение rpoB (Ва813) в качестве внутреннего контроля является важным фактором в оценке естественно аттенуированных штаммов, в которых отсутствует одна или обе плазмиды, хотя вероятность потери pX02 выше [25]. На основании полученных результатов была подтверждена видовая принадлежность штаммов и отсутствие плазмиды рХО2 в вакцинных штаммах.

MLVA типирование было проведено с использованием капиллярного электрофореза. Полученные значения размеровVNTR повторов приведены в таблице 2.Капиллярное разделение обладает преимуществами при проведении MLVA типирования в сравнении с электрофорезом в агарозномили полиакриламидных гелях. К преимуществам можно отнести высокую разрешающую способность до одного нуклеотида и возможность анализа нескольких локусов за счет мечения локусов разными флуоресцентными красителями [26]. Несмотря на высокую воспроизводимость получаемых результатов при капиллярном электрофорезе, нередко получаемый размер ПЦР продуктов отличается от фактических значений. Это, возможно, связано с типами приборов, характеристикой используемого полимера, разницей в движении размерного стандарта и ПЦР продуктов, отличие в движение ПЦР продуктов из-за конформаций. Обычно размер на всех аллелях изменяется на постоянное значение, но в некоторых случаях смещение увеличивается с увеличением размера аллеля, прямое секвенирование аллелей повышает достоверность получаемых результатов [27].

В связи с этим определена нуклеотидная последовательность аллелей 23VNTR маркеров методом секвенирования. В результате ПЦР с праймерами, предложеннымиListaс соавт.,был получен паттерн ПЦР фрагментов, варьирующих по размеру от 120 до более 800 п.н. (рисунок 2).

Локусы vrrB1, CG3, pX01, pX02, vrrB2 имели размер менее 300 п.н.,  что не позволило получить прямую нуклеотидную последовательность с использованием праймеров, предложенных Lista c соавт. В связи с этим была поставлена ПЦР реакция с подобранными праймерами, фланкирующими данный участок на достаточном удалении. Использование подобранных прамеров позволило получить ПЦР фрагменты от 350 до 550 п.н. (рисунок 3).

 

Прямую нуклеотидную последовательность локуса Bam30 не удалось получить из-за большой протяженности фрагмента и размера тандемных повторов, в дальнейшем требуется клонирование и подбор дополнительных праймеров. Фактические размеры остальных фрагментов отражены в таблице 2.

Название локуса (размер повтора, п.н.)   The name of locus (size of repeat, bp)	55 ВНИИВВиМ Депозитор 1   55-VNIIVViM Depositor 1		55 ВНИИВВиМ Депозитор 2   55-VNIIVViM Depositor 2		55 ВНИИВВиМ Депозитор 3   55-VNIIVViM Depositor 3		СТИ-1 Депозитор 1   STI-1 Depositor 1		СТИ-1 Депозитор 1   STI-1 Depositor 2		СТИ-1 Депозитор 3   STI-1 Depositor 3		Вирулентный штамм 280/6-15-В Virulentstrain 280/6-15-В
	Н.р.*	Ф.р.**	Н.р.	Ф.р.	Н.р.	Ф.р.	Н.р.	Ф.р.	Н.р.	Ф.р.	Н.р.	Ф.р.	Н.р.	Ф.р.
Bams1(21)	423.96	422	424.04	422	423.92	422	423.97	422	423.98	422	423.97	422	423.95	422
Bams3(15)	516.59	519	516.69	519	516.81	519	516.76	519	516.76	519	516.83	519	378.69	385
Bams5 (39)	378.57	385	378.53	385	378.65	385	378.61	385	378.48	385	378.61	385	378.69	385
Bams13(9)	451.39	454	451.39	454	451,42	454	451.44	454	451.42	454	451.35	454	451.4	454
Bams15(9)	608.91	607	608.87	607	608.96	607	608.96	607	608.9	607	608.9	607	608.93	607
Bams21 (45)	662.32	676	662.34	676	662.36	676	662.26	676	662.25	676	662.26	676	662.03	676
Bams22 (36)	716.71	735	716.52	735	717.21	735	716.89	735	716.57	735	716.86	735	716.87	735
Bams23 (42)	675.04	693	675.17	693	675.44	693	675.2	693	674.89	693	675.13	693	633.43	651
Bams24(42)	597.05	595	597.01	595	597.06	595	597.07	595	597.06	595	597.11	595	597.06	595
Bams25 (15)	393.18	391	393.15	391	393.2	391	393.22	391	393.19	391	393.15	391	393.11	391
Bams28 (24)	497.69	493	497.74	493	477.65	493	497.62	493	497.58	493	497.62	493	497.63	493
Bams30 (9)	891,49	Н/Д	891,49	Н/Д	891,56	Н/Д	891,67	Н/Д	891,54	Н/Д	891,67	Н/Д	864,39	Н/Д
Bams31 (9)	765.88	771	765.78	771	766.03	771	765.92	771	766.02	771	766.03	771	766	771
Bams34 (39)	416.08	425	416.17	425	416.15	425	416.12	425	416.15	425	416.15	425	416.0	425
Bams44 (39)	408.21	417	408.29	417	408.54	417	408.49	417	408.15	417	408.5	417	408.58	417
Bams51(45)	497.69	493	497.67	493	497.4	493	497.73	493	497.74	493	497.75	493	497.78	493
vrrA (12)	307.35	313	307.28	313	307.39	313	307.33	313	307.38	313	307.32	313	307.18	313
vrrB1(9)	223.67	229	223.62	229	223.67	229	223.63	229	223.66	229	223.64	229	223.66	229
vrrB2 (9)	154.96	162	155.01	162	155.05	162	155.06	162	154.85	162	155.05	162	155.07	162
vrrC1 (9)	605.38	616	605.17	616	605.53	616	605.22	616	605.13	616	605.32	616	605.53	616
vrrC2 (18)	594.48	604	594.56	604	594.54	604	594.52	604	594.45	604	594.56	604	594.59	604
CG3 (5)	148.32	153	148.54	153	148.49	153	148.38	153	148.31	153	148.39	153	148.59	153
pX01(3)	123.6	129	123.7	129	123.75	129	126.74	132	126.51	132	126.52	132	129.72	135
pX02 (2)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	134.8	139
*Н.р. – наблюдаемый размер при капиллярном разделении; **Ф.р. – фактический размер на основании прямой нуклеотидной последовательности; ***Н/Д – нет данных   *Н.р. – observed size at capillary separation; **Ф.р. – actual size based on direct nucleotide sequence; *** Н/Д – no data

 

Наблюдаемый и фактический размер аллелей отличался в некоторых локусах на 19 нуклеотидовBams22 (18 нуклеотидов у локуса Bams23), что в некоторых случаях составляло 50% длины повтора. Таким образом, верификация данных прямым секвенирование на первом этапе внедрения процедуры MLVA типирования является важным шагом. В последующем создание типовых штаммов (образцов ДНК) позволит корректировать значения без прямого секвенирования.

Назначение аллелей осуществляли согласно размеру и корректированным правилам назначения аллелей штамма AmesAncestor [28], за исключением локуса Bam30, значение которого было определено согласно Lista [18]. В результате проведенных исследований значения 24VNTR повторов получены для всех  анализируемых вакцинных штаммов, для полевого штамма получены значения всех 25 аллелей (таблица 3). Дубликация пиков, указывающая на присутствие двух штаммов или диссоциацию, в образцах не выявлена. Вакцинные штаммы B. anthracis55 ВНИИВВиМи B. anthracis СТИ-1имели единственное различие по локусу pXO1aat. Результаты амплификации локусов pXO2at, локализованных на плазмиде капсулообразования pXO2, были отрицательны у всех вакцинных штаммов, что связано с одной из важнейших характеристик этих штаммов –отсутствием данной плазмиды. У вирулентного штамма различались локусы Bam3, Bam23, pX01, а также присутствовала плазмида pXO2.

 

Название VNTR  локуса The name of VNTR locus	55 ВНИИВВиМ Депозитор 1 55-VNIIVViM Depositor 1	55 ВНИИВВиМ Депозитор 2 55-VNIIVViM Depositor 2	55 ВНИИВВиМ Депозитор 3 55-VNIIVViM Depositor 3	СТИ-1 Депозитор 1 STI-1 Depositor 1	СТИ-1 Депозитор 2 STI-1 Depositor  2	CТИ-1 Депозитор 3 STI-1 Depositor  2	Вирулентный штамм 280/6-15-В Virulentstrain 280/6-15-В	In silico MLVA СТИ-1 (STI-1)	In silico MLVA 55 ВНИИВВиМ (55-VNIIVViM
Bams1	13	13	13	13	13	13	13	13	13
Bams3	24	24	24	24	24	24	30	18	24
Bams5	7	7	7	7	7	7	7	6	7
Bams13	30	30	30	30	30	30	30	30	30
Bams15	45	45	45	45	45	45	45	45	45
Bams21	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Bams22	16	16	16	16	16	16	16	15	НД
Bams23	12	12	12	12	12	12	11	11	НД
Bams24	11	11	11	11	11	11	11	9	11
Bams25	13	13	13	13	13	13	13	13	13
Bams28	14	14	14	14	14	14	14	14	14
Bams30	75	75	75	75	75	75	72	НД	НД
Bams31	64	64	64	64	64	64	64	НД	64
Bams34	8	8	8	8	8	8	8	8	8
Bams44	8	8	8	8	8	8	8	8	8
Bams51	9	9	9	9	9	9	9	НД	9
vrrA	3	3	3	3	3	3	3	3	3
vrrB1	19	19	19	19	19	19	19	19	19
vrrB2	12	12	12	12	12	12	12	12	12
vrrC1	57	57	57	57	57	57	57	57	57
vrrC2	21	21	21	21	21	21	21	21	21
CG3	1	1	1	1	1	1	1	1	1
pX01	7	7	7	8	8	8	9	7	8
pX02	0	0	0	0	0	0	9	0	0
*Н/Д – нет данных   *Н/Д – no data

 

Дополнительно был проведен in silico MLVA анализ штаммов Bacillus anthracis 55 ВНИИВВиМ (NZ_MLJX00000000.1) и Bacillus anthracis СТИ-1 (NZ_MJAW00000000.1) на основании полногеномных данных (таблица 3). Для штамма Bacillus anthracis 55 ВНИИВВиМ методом in silico не удалось получить значения локсов Bam22, Bam 23и Bam30. Для штамма Bacillus anthracis СТИ-1не удалось получить значения локусов Bam30, Bam31 иBam51, так как локусы находились в дистальной части контигов. Значения локусов Bam5, Bam22, Bam23  и Bam24вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ-1отличались от полученных нами результатов, что, возможно, связано с ошибками в сборке контигов при полногеномном секвенировании или с изменением в количестве тандемных повторов в результате длительного депонирования штаммов в коллекции микроорганизмов. В последующем для совершенствования процедуры определения генетической стабильности и отработки инструкции контроля качества вакцин необходимо провести MLVA анализ типовых культур вакцинных штаммов, а также штаммов различных производителей. Включение различных партий позволит улучшить понимание о генетической стабильности готовых вакцин.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование метода MLVA25 позволяет различать штаммы сибиреязвенных вакцин на генетическом уровне, что является немаловажным преимуществом при контроле вакцинных препаратов. Впервые были получены MLVA профили 24 VNTR повторов вакцинных штаммов депонированых в Казахстане. Результаты метода MLVA25 иллюстрируют генетическую однородность вакцинных штаммов различных производителей, различие в локусе pXO1 могут быть использованы при дифференциации вакцинных штаммов Полученные результаты могут быть применены в ветеринарной практике при оценке генетической стабильности вакцинных штаммов и достоверность их происхождения.

 

Финансирование

Работа выполнялась в рамках проекта «Разработка протокола MLVA типирования штаммов Bacillus anthracis» в рамках реализации государственного заказа по научно-технической программе «Создание диагностических препаратов и вакцин на основе использования молекулярно-генетических методов для обеспечения ветеринарной безопасности».

 

 

MLVA- 25 ӘДІСІМЕН  Bacillus anthracis СТИ-1 ЖӘНЕ B. anthracis 55 ВВМЖРҒЗИ ВАКЦИНДІ ШТАММДАРЫНЫҢ ГЕНЕТИКАЛЫҚ БІРТЕКТІЛІГІН ТАЛДАУ

 

 

ТҮЙІН  

Тұрақтылықтың генетикалық бақылауы мен штаммды идентификациялау вакцинаны бақылауда елеулі қосымша болуы мүмкін.Сібір жарасының жоғары генетикалық тұрақтылығы ДНҚ-ның жоғары айнымалы аймақтарында хаттамаларды қолдануды талап етеді. Тандемдік қайталаулар гипервариабельді ДНҚ жатады. 25 локусың тандемдік қайталау талдауы (MLVA-25),генотиптің географиялық таралуын бақылауға мүмкіндік бере отырып, өзін Bacillus anthracis далалық штаммдарын генотиптеудің жоғарғы дискриминациялық әдісі ретінде ұсынды.

Әдіс вакцинді штаммдардың генетикалық тұрақтылығы мен штаммдық идентификациялауда оңай интерполяциялануы мүмкін. Дегенмен, бүгінгі күнге дейін ТМД елдерінде вакцинациялау үшін қолданылатын MLVA-25 вакцина штаммдарының генотиптері туралы мәліметтер жоқ.

Берілген мақалада MLVA-25 қолдану арқылы Қазақстанның үш депозиторларымен депонирленген Bacillus anthracis СТИ-1 және B. аnthracis 55 ВВМЖРҒЗИ вакцинді штаммдарының генотиптеу нәтижелері келтірілген. Үш депозиторлардың вакцинді штаммдардың MLVA профилі өзара ерекшеленді. Bacillus anthracis СТИ-1 пен B. anthracis 55 ВВМЖРҒЗИ өзара тек pXO1aat локусында 1 тандемдік қайталау бойынша ерекшеленді. Bacillus anthracis СТИ-1 пен B. аnthracis 55 ВВМЖРҒЗИ MLVA профильдерін салыстыру мен in silico әдісімен алынған толық геномды мәліметтер негізінде анықталған локустардың Bam22, Bam23 мағыналарының сәйкес келмеуі, сонымен қатар Bacillus anthracis СТИ-1 локустары Bam5 және Bam24.

Зерттеулер, MLVA талдауы жоғарғы дискриминациалық әдіс екенін және вакцинді препараттарды бақылауда қолдануға болатынын көрсетті. Рәсімді стандарттау үшін үлгі дақылдарды талдауды талап етеді.

Негізгі сөздер: Bacillus anthracis, MLVA типирование, VNTR аллелдер,вакцинді штаммдар, сібір жарасы.

---

 

• < Prev
• Next >