3/2016

 

УДК 021.57.083 – 048.86 616-007/616.981-42

 

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО И ЭРИТРОЦИТАРНОГО СОРБЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ С РЕЦЕПТОРАМИ К ЛИПОПОЛИСАХАРИДАМ БРУЦЕЛЛ

 

Каральник Б.В.1, Денисова Т.Г.1, Омарова М.Н.1, Жунусова Г.Б.1, Тугамбаев Т.И.2, Закарян С.Б.2, Федосов Ю.С.1
1Научный центр гигиены и эпидемиологии им. Х. Жуматова
ул. Макатаева, 34, Алматы, 050002, Казахстан
2Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций 
ул. Капальская, 14, Алматы, 050054, Казахстан
lbimvac@
mail.ru

 

АБСТРАКТ

Цель работы – получение на основе синтетического сорбента иммунореагентов для ранней диагностики бруцеллеза и сравнение их с ранее разработанными эритроцитарными иммунореагентами в экспериментах иммунизации животных и обследования больных. Использованы кролики, ветеринарные бруцеллезные вакцины для мелкого и крупного рогатого скота, липополисахариды (ЛПС) различных видов бруцелл и иерсиний, химически активированные (c -NHили -COOH группами) полистиреновые бусы (beads) диаметром 2 мкм, меченные и не меченные флуорохромом (изотиоцианат натрия), разработанный ранее бруцеллезный эритроцитарный иммунореагент для выявления лимфоцитов с рецепторами к антигену (ЛфР), фракции мононуклеаров иммунизированных кроликов и больных с подозрением на бруцеллез. Применены методы адгезии клеток/корпускул и ее блокирования ЛПС, хронометраж подсчета ЛфР, статистические методы сравнения серий. На основе синтетического сорбента разработан бруцеллезный иммунореагент и определены его преимущества в сравнении с бруцеллезным эритроцитарным иммунореагентом: отсутствие неспецифической адгезии за счет связывания сорбента, а не ЛПС и более высокая точность определения ЛфР; необязательность параллельного определения связывания лимфоцитами сорбента; упрощение и уменьшение затрат времени на подсчет ЛфР. Особенности сорбента не влияют на определение ЛфР, специфичных к ЛПС таксономически близких бактерий. Полученные результаты обосновывают целесообразность применения для определения ЛфР иммунореагента на синтетическом сорбенте.

Ключевые слова: сорбированные иммунореагенты, ранняя диагностика, бруцеллез.


ВВЕДЕНИЕ

Известны различные иммунологические методы диагностики бруцеллеза: агглютинационные (Хаддлсона, Райта, Роз Бенгал тест), иммуноферментные (ELISA– определение антител изотиповIgM, IgG, IgA), ELISPOT (определение продукции γ-интерферона лимфоцитами, примированными антигеном возбудителя, в ответ на стимул гомологичным антигеном). Однако применение агглютинационныхи иммуноферментных методов не решает задачу ранней диагностики из-за сравнительно позднего развития антительного ответа. МетодELISPOT мог бы решить эту задачу, если бы его выполнение не занимало несколько суток. Выявление лимфоцитов с рецепторами (ЛфР) к липополисахариду(ЛПС) бруцелл, как показано в комплексе работ с использованием ранее разработанного эритроцитарного иммунореагента [1], оказалось пригодным для ранней диагностики бруцеллеза тестом [2-5].

Одновременно было выяснено, что использование эритроцитов в качестве сорбента имеет определенные недостатки. Во-первых, в иммунореагенте для определения ЛфР с целью минимизации спонтанной (неспецифической) адгезии с лимфоцитами используют эритроциты быка. Поскольку связываемый антиген не блокирует всю поверхность эритроцита [6],это может привести к получению ложноположительных (за счет взаимодействия собственных эпитопов мембраны эритроцита с соответствующим рецептором лимфоцитов) результатов теста при определении ЛфР у рогатого скота, подлежащего обследованию на бруцеллез. Более того, даже при обследовании людей выявляют небольшое содержание лимфоцитов, связывающих контрольный эритроцитарный сорбент, не нагруженный ЛПС бруцелл. Во-вторых, для обеспечения стабильности сорбента и, соответственно, иммунореагента эритроциты нужно фиксировать достаточно токсичным уксусным альдегидом. Поэтому целесообразно разработать иммунореагенты такого же назначения (для ранней диагностики бруцеллеза) на основе синтетического сорбента.

Цель работы – получение на основе более инертного, синтетического сорбента бруцеллезных иммунореагентов для ранней диагностики заболевания и сравнение их с ранее разработанными эритроцитарными иммунореагентами в экспериментах иммунизации животных и обследования больных.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали 8 беспородных кроликов, бруцеллезные вакцины для иммунизации крупного и мелкого рогатого скота производства ТОО «Антиген», Казахстан; разработанный нами ранее бруцеллезный эритроцитарный иммунореагент для выявления ЛфР [1]; выделенные по Westphalна холоде[7] липополисахариды следующих бактерий:Brucellamelitensis, Brucellaabortus, Brucellasuis, Yersiniapseudotuberculosis, Yersiniapestis, Yersiniaenterocoliticaсероваров 03, 05 и 09;и химически активированные (c -NH2 или -COOH группами) полистиреновые бусы (beads) диаметром 2 мкм, меченные и не меченные флуорохромом (изотиоцианат натрия) производства SigmaAldrich, Германия, фиколл 400 производстваSigmaAldrich, USA, триомбраст производстваОАО«Фармак»,Украина, 25% глутаровый альдегид производстваMerck,Германия,метиленовыйсиний производстваSun Pharmaceuticals, Индия; фосфатный буфер, рН 7.2.Использовали центрифугу СМ-6М производстваELMI, Латвия, микроскоп производстваZeiss,Германия, микродозаторы производстваLaborgerateGmbH, Германия.

Выделение фракции мононуклеаров из гепаринизированной крови выполняли на градиенте плотности фиколл-триомбраст 1.077 г/мл. ЛфР определяли методом адгезии, смешивая равные объемы взвесей выделенных мононуклеаров и иммунореагентаэритроцитарного или на основе синтетического сорбента при соотношении корпускулы/клетки60:1. После экспозиции (5 мин при 37 и 1 час при 4оС) из осадка корпускул делали мазок на предметном стекле, фиксировали его 96% этиловым спиртом и после испарения спирта окрашивали мазок 0,1% раствором метиленового синего в течение 4 мин. Количество лимфоцитов, связавших более 2 корпускул, подсчитывали в 7 сотнях лимфоцитов порознь.

В работе применены различные статистические методы частных сравнений серий. Результат анализа считали значимым при вероятности нуль-гипотезы не более 0,05.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор синтетического сорбента. Размер бус (диаметр 2 мкм) выбран таким образом, чтобы в поле зрения микроскопа было легко дифференцировать лимфоциты (диаметр 8 мкм) и бусы. Выбор бус по способу их химической активации осуществлен по результатам комплексного опыта, в котором у кроликов, иммунизированных вакцинами B. melitensisи B. abortus, определяли оптимальную для выявления ЛфР дозу гомологичных ЛПС для бус с амино- и карбоксильными группами при связывании антигена без конъюгирующего агента. Для этого взабуференном, pH 7,2 0,85% растворе NaCl были приготовлены ЛПС соответствующих бруцеллконцентрации 0 (контроль), 16, 31, 62, 125, 250, 500, 1000 и 2000 мкг/мл. Каждый из этих растворов смешивали с равным объемом 0,5% суспензии каждого варианта бус, смеси выдерживали 90 мин при 45оС и оставляли при 4оС сутки.Нагруженные ЛПС бусы трижды отмывали при центрифугировании и суспендировали в забуференном, pH 7,2 0,85% раствореNaCl до содержания корпускул 1,2∙108кл/мл. Определение ЛфР проводили вофракции мононуклеаров, выделенной из крови кроликов через 10 дней после иммунизации. Результаты приведены в таблице 1.Видно, что аминированные бусы без конъюгации не связывают ЛПС. Поэтому для приготовления бруцеллезного ЛПС-иммунореагента были использованы карбоксилированные бусы. Чувствительность иммунореагентов, полученных при нагрузке бус растворами ЛПС концентрации 2000 и 1000 мкг/мл, максимальна и не различается, а при использовании растворов более низкой концентрации она резко уменьшается.

 

Таблица 1. Выбор рабочих доз ЛПС для получения иммунореагентов на основе синтетического сорбента
Table 1. Choice of working doses of LPS for receiving of immunologic reagents on the base of synthetic sorbent

Специфич

ность иммуногенаи иммуно

реагента

 

Specificity of immunogen and immunologic reagent

Акти-вациябус

 

Activation of beads

Кро-лик

 

Rabbit

Относительное(%) содержание АСЛ*, выявленныхиммунореагентами,

полученнымиприразличных дозахЛПС, мкг/мл

 

Relative (%) contentABL detected with immunologic reagents received at different doses of LPS, mcg/ml

2000

1000

500

250

125

62.5

31.2

15.6

0

(контроль)

 

0

(control)

Brucella

melitensis

-COOH

1

16.0±0.3

15.9±0.3

6.6±0.3

0.3±0.2

0

0

0

0

0

2

15.7±0.2

16.4±0.2

7.7±0.2

0.3±0.2

0

0

0

0

0

1,2

15.9±0.2

16.1±0.2

7.1±0.2

0.3±0.1

0

0

0

0

0

-NH2

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

2

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Brucella

abortus

-COOH

3

16.4±0.2

16.7±0.2

6.6±0.2

0.3±0.2

ндnd

ндnd

ндnd

ндnd

0

4

15.6±0.2

16.0±0.4

6.1±0.3

0.1±0.1

ндnd

ндnd

ндnd

ндnd

0

3,4

16.0±0.2

16.4±0.2

6.4±0.2

0.2±0.2

ндnd

ндnd

ндnd

ндnd

0

-NH2

3

0

0

0

0

ндnd

ндnd

ндnd

ндnd

нд

nd

4

0

0

0

0

ндnd

ндnd

ндnd

ндnd

нд

nd

*Средняя и ее средняя квадратическая ошибка;

нд – не делали

 

*Middle and her middle quadratic error;

nd – not done

С иммунореагентами, полученными при дозах ЛПС 16-125 мкг/мл, не выявлены даже единичные ЛфР. Описанная зависимость практически одинакова для ЛПС различных бруцелл: оптимальной чувствительностью характеризуются иммунореагенты, полученные при нагрузке карбоксилированных бус ЛПС обоих видов бруцелл в дозе 1000 мкг/мл.

Сопоставление чувствительности бруцеллезных иммунореагентов на основе двух сорбентов (эритроцитарных синтетических) выполнено на лимфоцитах кроликов, иммунизированных за 10 дней до анализа ветеринарными вакцинами специфичности Brucellamelitensis (кролики 5 и 6) и B. abortus(кролики 7 и 8). Как видно из приведенных в таблице 2 данных, чувствительность иммунореагентов, приготовленных на основе двух сорбентов, в опыте иммунизации кроликов практически одинакова при определении ЛфР специфичности как B. melitensis, так и B. abortus.

Несмотря на выбор специального метода фиксации эритроцитов, минимизирующего их спонтанное связывание с антителами или с лимфоцитами – фиксацию ацетальдегидом [8, 9], такой сорбент все же, хотя и в небольшом проценте случаев, связывается лимфоцитами. Для более точного определения ЛфР приходилось параллельно выполнять тест с эритроцитами, не нагруженными антигеном.

 

Таблица 2. Сравнение чувствительности бруцеллезных иммунореагентов на основе эритроцитарного и синтетического сорбентов для выявления АСЛ у иммунизированных кроликов
Table 2.Comparison of sensitivity of brucellosis immunologic reagents on the base of erythrocyte and synthetic sorbents for detection of ABL at immunized rabbits

Специфичность иммуногена и иммунореагента

 

Specificity of immunogen and immunologic reagent

Кролик

 

Rabbit

Выявление АСЛ ( ±S ) при тестировании с иммунореагентом на основе сорбента

 

Detection of ABL ( ±S ) at testing with

immunologic reagent on the base of sorbent

Р*

эритроцитарного

 

erythrocyte

cинтетического

 

synthetic

Brucella

melitensis

5

14.4±0.5

15.1±0.3

0.3>Р>0.2

6

14.0±0.4

14.6±0.2

0.3>Р>0.2

Р5,6**

0.3>Р>0.2

0.3>Р>0.2

-

5,6

14.2±0.2

14.9±0.2

0.1>Р>0.2

Brucella

abortus

7

13.4±0.5

13.6±0.2

>>0.05

8

13.4±0.3

13.9±0.1

>>0.05

Р7,8**

1.0

0.4>Р>0.3

 

7,8

13.4±0.3

13.7±0.1

>>0.05

 

Мы проверили, связываются ли с лимфоцитами иммунизированных B.melitensis и B.abortusкроликов карбоксилированные бусы, не нагруженные ЛПС бруцелл– контрольные реагенты (таблица 3). Видно, что контрольные эритроцитарные реагенты связываются лимфоцитами с частотой от 2,0 до 2,7%.Параллельная проверка контрольных иммунореагентов (синтетического сорбента)не выявила такого связывания. Это преимущество позволяет при применении иммунореагента на основе синтетического сорбента выполнять определение ЛфР без параллельного теста с контрольным реагентом. Таксономическую специфичность определения ЛфР с полученными на основе синтетического сорбента иммунореагентами проверили методом ингибиции выявления ЛфР: лимфоциты тех же иммунизированных кроликов 5-8 предварительно экспонировали с растворами ЛПС (200 мкг/мл) различных бактерий – гомологичных иммуногену и иммунореагенту и гетерологичных.

 

Таблица 3. Связывание контрольных иммунореагентов – эритроцитарного и синтетического лимфоцитами иммунизированных кроликов
Table 3. Binding of control immunologic reagents – erythrocyte and synthetic by lymphocytes of immunized rabbits

Иммуноген

 

Immunogen

Кролик

 

Rabbit

Связывание лимфоцитами контрольных

реагентов ( ±S )

 

Binding of control reagents by lymphocytes

Р*

эритроцитарного

 

erythrocyte

синтетического

 

synthetic

Brucella

melitensis

5

2.14±0.34

0

<<0.01

6

2.71±0.36

0

<<0.01

Р5,6**

0.3>Р>0.2

1.0

-

5,6

2.43±0.25

0

<<0.01

Brucella

abortus

 

7

2.29±0.18

0

<<0.01

8

2.00±0.31

0

<<0.01

Р7,8**

0.5>Р>0.4

1.0

-

7,8

2.14±0.06

0

<<0.01

 

Р***

0.3>Р>0.2

1.0

-

( ±S ) – средняя и ее средняя квадратическая ошибка, %;

*Вероятность нуль-гипотезы при сравнении связывания эритроцитарного и синтетического контрольныхиммунореагентов;

**Вероятность нуль-гипотезы при сравнении связывания контрольного реагенталимфоцитами двух кроликов;

***вероятность нуль-гипотезы при сравнении связывания контрольного реагента лимфоцитами кроликов, иммунизированных антигенами бруцелл двух видов.

 

( ±S ) –middle and her quadratic error;

*Probability of the zero-hypothesis at comparison ofbinding of erythrocyte and synthetic control reagents;

**Probability of the zero-hypothesis at comparison of binding of control reagent by lymphocyte of 2 rabbits;

***Probability of the zero-hypothesis atcomparison of binding of control reagent by lymphocytes of rabbits immunized with antigens of Brucellaof two species

Из приведенных в таблице 4 данных видно, что гомологичные ЛПС вызывали очень значительное уменьшение количества ЛфР, выявляемых при использовании эритроцитарныхиммунореагентов специфичности как B.melitensis(73-76, в среднем по группе 74,9±1,1%), так и B.abortus(74-77, в среднем по группе 75,6±0,7%). При применении иммунореагентов на основе синтетического сорбента это уменьшение было достоверно (P<0,001) более выраженным (79-80 и 82, в среднем по группе 80,0±0,9 и 82,3±0,9% при определении ЛфР специфичности B.melitensisиB.abortusсоответственно).

ЛПС гетерологичных видов бруцелл у тех же кроликов также вызывали ингибицию, но существенно (P<<0,001), в 2,9-9,0 разменьшую, чем ЛПС гомологичных бруцелл. Так, при применении эритроцитарных иммунореагентов специфичности B.melitensisЛПС B.abortus вызвал ингибирование только на 24-27, в среднем по группе – на 25,4±0,9%), а ЛПС B.suis – соответственно на 20-25, в среднем по группе – на 22,2±1,2%. У кроликов, иммунизированных вакциной B.abortus, при применении эритроцитарных реагентов специфичности B.abortus, ингибитор – ЛПС B.melitensisуменьшал выявление ЛфР на 13-14, всреднем по группе – на 13,3±0,8%, а ЛПС B.suis – соответственно на 8-10, в среднем по группе – на 9,4±0,8%.

При применении иммунореагентов на основе синтетического сорбента ЛПС B.abortus уменьшал выявление ЛфР специфичности B.melitensis на 12-18, в среднем по

группе на 14,8±1,2%, а ЛПС B.suis– на 15-20, в среднем по группе – на 17,3±1,1%. ЛПС B.melitensis ингибировал выявление ЛфР специфичности B.abortus на 7-10, в среднем по группе на 8,8±0,8%, а ЛПС B.suis – на 8-9, в среднем также на 8,8±0,8%.

Известно, что в ЛПС Brucellamelitensis и YersiniaenterocoliticacеровараO9 имеются общие антигенные детерминанты [10-13]. Эти перекресты выявляются не только в тестах определения антител, но и в тесте обнаружения ЛфР [14]. По результатам настоящего исследования, при использовании эритроцитарных иммунореагентов ЛПС Y.enterocoliticaO9, примененный в качестве ингибитора, подавлял выявление ЛФР специфичности B.melitensis на 13-15, в среднем на 14,1±0,7%, а специфичности B.abortus– на 12-14, в среднем на 12,7±0,9%. При использовании иммунореагентов на основе синтетического носителя ингибиция этим же ЛПС выявления ЛфР специфичности B.melitensis составила 16-17, в среднем по группе 16,3±0,8%, а специфичности B.abortus у каждого кролика – около 10 и по группе в среднем 9,9±1,0%. Существенное различие между степенью ингибиции ЛПС Y.enterocoliticaO9 выявления ЛфР специфичности как B.melitensis, так и B.abortus в зависимости от природы сорбента в иммунореагенте не обнаружено (Р>0,05). В целом полученные результаты подтвердили наличие общих эпитопов у ЛПС B.melitensisи Y.enterocoliticaсеровараO9, а также значение этих антигенных связей при тестировании ЛфР (таблицы 4 и 5).

Такие же антигенные перекресты выявлены между B.abortus и Y.enterocoliticaО9 при тестировании ЛфР в опыте ингибиции (таблица 4). Важно подчеркнуть, что, в отличие от ЛПС Y. Enterocolitica серовара О9, у ЛПС иерсиний других сероваров этого вида (О3 и О5) общие эпитопы в опытах ингибиции выявления ЛфР специфичности B.melitensisи B.abortus не обнаружены. Не обнаружены они и у ЛПС других видов иерсиний – Y.pseudotuberculosis и Y.pestis(таблица 5).

 

Таблица 4. Оценка специфичности бруцеллезных иммунореагентов на основе эритроцитарного и синтетического сорбентов для выявления лимфоцитов с рецепторами к ЛПС бруцелл (опыт А)
Table 4. Assessment of specificity of brucellosis immunologic reagents on the bases of erythrocyte and synthetic sorbents for determination of lymphocytes with receptors to Brucella LPS (experiment A)

Иммуноген

и иммунореагент

Immunogen

 

Кролик

Rabbit

Степень ингибиции( ±S ), %, липополисахаридами выявления ЛфР с иммунореагентами на основе сорбента

 

Degree of inhibition by lypopolysacharides( ±S ), % of the ABL revealing with immunologic reagents  on the bases of sorbent

эритроцитарного

 

erythrocyte

cинтетического

 

synthetic

Ингибитор – ЛПС

 

Inhibitor – LPS

Ингибитор

Inhibitor

Ингибитор – ЛПС

 

Inhibitor – LPS

ИнгибиторInhibitor

Brucella

melitensis

Brucella

abortus

Brucella

suis

Yersinia

enteroco-litica O3

Yersinia

enteroco-litica O5

Yersinia

enteroco-litica O9

Физраствор

Physiologic solution

Brucella

melitensis

Brucella

abortus

Brucella

suis

Yersinia

enteroco-litica O3

Yersinia

enteroco-litica O5

Yersinia

enteroco-litica O9

Физраствор

Physiologic solution

Brucellamelitensis

5

76.3±0.8

26.6±1.2

24.8±1.2

0.09±1.6

1.2±1.9

14.9±0.8

0

79.2±0.8

17.9±1.1

19.9±1.5

-1.0±1.0

-1.0±1.0

16.9±1.2

0

6

73.4±1.1

24.3±1.3

19.5±1.5

-0.13±2.2

0±1.6

13.4±1.2

0

80.5±1.6

11.7±1.2

14.7±0.8

-1.0±1.0

1.9±1.2

15.6±1.1

0

5,6

74,9±0.8

25.4±0.9

22.2±1.2

0.09±0.8

0.6±1.2

14.1±0.7

0

80,0±0.9

14.8±1.2

17.3±1.1

-0.5±0.5

0.5±0.8

16.3±0.8

0

Р

<0.001

<<0.001

0.01>Р>0.001

0.2>Р>0.1

1.0>Р>0.9

0.1>Р>0.05

-

 

 

 

 

 

 

-

Brucellaabortus

7

12.7±1.3

74.5±0.8

10.4±1.1

1.0±1.0

2.1±1.3

11.7±1.4

0

10.5±1.5

82.2±1.3

9.4±1.3

-1.1±1.1

1.1±1.1

9.5±1.4

0

8

13.9±1.1

76.6±1.0

8.5±1.0

1.1±1.1

-1.1±1.1

13.8±0.9

0

7.2±0.1

82.5±1.4

8.2±1.0

-1.0±1.8

-1.0±1.0

10.3±1.4

0

7,8

13.3±0.8

75.6±0.7

9.4±0.8

1.0±0.7

0.5±0.9

12.7±0.9

0

8.8±0.8

82.3±0.9

8.8±0.8

-1.0±1.0

0.04±0.8

9.9±1.0

0

Р

<<0.001

<<0.001

0.6>Р>0.5

0.2>Р>0.1

0.8>Р>0.7

0.05>Р>0.02

-

 

 

 

 

 

 

-

( ±S ) – средняя и ее средняя квадратическая ошибка, %;

Р – вероятность нуль-гипотезы при сравнении степени ингибиции, выявленной при использовании иммунореагентов на основе эритроцитарного и синтетического сорбентов.

 

( ±S ) middle and her quadratic error;

P –probability of the zero-hypothesis at comparison of inhibition degree at use of immunologic reagents on the bases of erythrocyte and synthetic sorbents.

 

Таблица 5. Степень ингибициилипополисахаридамииерсиний выявления ЛфР, специфичных для Brucellamelitensis (опыт Б), %
Table 5.Inhibition degreeby Yersinia lypopolysaccharides of revealing of ABL specific to Brucella melitensis (experiment B), %

Кролик

 

Rabbit

Степеньингибиции* липополисахаридами

 

Degree of inhibition %* by lypopolysacharides

Brucella

melitensis

Yersinia

enterocolitica O9

Yersinia

pseudotuberculosis

Yersinia

pestis

5

79.5±1.0

20.5±1.0

1.7±1.1

0

6

82.0±0.5

16.1±1.1

1.0±1.0

-2.9±1.4

5,6

80.7±0.8

18.3±0.8

1.3±0.7

-1.4±1.0

Р

-

<<0.001

<<0.001

<<0.001

*Степень ингибиции – уменьшение % количества выявленных ЛфР в результате предварительной экспозиции лимфоцитов с раствором ЛПС, 200 мкг/мл; 

Р–вероятность нуль-гипотезы при сравнении ингибиции гомо- (Brucellamelitensis) и гетерологичными (иерсиниозными ) ЛПС.

 

*Degree of inhibition – decrease, % of quantity of revealing ABL) consequently of preliminary exposition of lymphocytes with solution of LPS, 200 mcg/ml;

P –probability of the zero-hypothesis at comparison of inhibition degree by the homo-(Brucella melitensis) and heterologic (Yersinia) LPS.

 

Полученные результаты подтвердили, что ингибирование выявления ЛфР растворенными антигенами является эффективным способом оценки специфичности как сорбированных иммунореагенов, так и результатов тестов с их использованием. Дополнительным показателем эффективности указанного способа явилось полное отсутствие ингибирования (Р>>0,05) примененными ЛПС связывания контрольного эритроцитарного иммунореагента лимфоцитами иммунизированных кроликов (таблица 6).

Суммируя результаты сравнительной оценки бруцеллезных иммунореагентов для выявления ЛфР по данным проведенных исследований, отметим, что разработанный иммунореагент на основе синтетического сорбента показал высокую чувствительность (при обследовании иммунизированных кроликов – не меньшую, а при обследовании больных людей даже более высокую, чем у эритроцитарного предшественника) и более высокую специфичность. В отличие от эритроцитарного прототипа он не связывал сам сорбент (таблица 3), что позволяет отказаться от выполнения параллельного теста с контрольным иммунореагентом и, соответственно, упростить определение ЛфР. Показано, что выявленные по результатам опытов ингибиции частичные антигенные перекресты между бруцеллами трех видов при иммунном ответе по ЛфР не связаны с особенностями сорбента в иммунореагенте, а обусловлены таксономической близостью этих бактерий. Известные, по результатам агглютинационных и адгезивных реакций, антигенные связи между ЛПС Y.enterocolitica О9 и B.melitensis подтверждены в этой работе. Подобные связи, определяемые по данным ингибиции выявления ЛфР, обнаружены также между ЛПС Y.enterocoliticaО9и B.abortus. И в этих случаях особенности сорбента в иммунореагенте не имеют значения: антигенные перекресты обусловлены только структурой ЛПС. Такие взаимодействия, как известно, сохраняются даже после предварительной обработки бруцеллезных антигенных препаратов 0,01M раствором ЭДТА, предотвращающей неспецифические результаты ряда серологических тестов на бруцеллеза [11]. Поэтому можно полагать, что аффинитет перекрестных взаимодействий, обусловленных таксономической близостью вышеуказанных бактерий, достаточно высок.

Далее провели сравнительное изучение затрат времени на подсчет ЛфР, выявляемых при помощи иммунореагентов на основе эритроцитарного и синтетического сорбентов (таблица 7).Полученные результаты показали, что при анализе проб, содержащих ЛфР, время, затрачиваемое на подсчетЛфРсреди 700 лимфоцитов при использовании иммунореагента на основе эритроцитарного сорбента, колеблется от 15 до 22 мин, в среднем – 20 мин, а при использовании в иммунореагенте синтетического сорбента колеблется от 14 до 15 мин, в среднем 14,6 мин. Кратность сокращения времени за счет применения синтетического сорбента составила в среднем 1,4±0,1 раза. Это преимущество имеет место (P<<0,001), несмотря на выявление у обследованных больных при использовании иммунореагента на основе синтетического сорбента более высокого (0,05>P>0,02) содержания ЛфР (в среднем по группе 5,1±0,3%), чем при использовании иммунореагента на основе эритроцитарного сорбента (в среднем по группе 4,1±0,2%). При отсутствии ЛфР в мазках время, затраченное на получение результата, практически не зависит от особенностей сорбента: 14,7±0,1 и 14,5±0,1 мин при иммунореагентах на эритроцитарном и синтетическом сорбентах соответственно. 

 

Таблица 6. Влияние ингибициилипополисахаридами на связывание контрольного эритроцитарного реагента лимфоцитами иммунизированных кроликов
Table 6. Influence of inhibition by lypopolysaccharides on the binding of control erythrocyte reagent by lymphocytes of immunized rabbits

Иммуноген

 

Immunogen

 

Кролик

 

Rabbit

Относительное содержание лимфоцитов, связавших контрольный эритроцитарный реагент ( ±S ), %

послеингибиции

 

Relative content of lymphocytes binding the control erythrocyte reagent ( ±S ), % after inhibition

липополисахаридом

 

by lypopolysaccharide

физраствором

 

by physiologic solution

Brucella

melitensis

Brucella

abortus

Brucella

suis

Yersinia

enterocolitica O3

Yersinia

enterocolitica O5

Yersinia

enterocolitica O9

(контроль)

 

control

Brucellamelitensis

5

2.29±0.18

2.29±0.18

2.29±0.18

2.14±0.14

2.29±0.18

2.29±0.29

2.14±0.34

6

2.57±0.20

2.43±0.20

2.43±0.20

2.57±0.43

2.71±0.47

2.71±0.29

2.71±0.36

 5,6

2.43±0.14

2.36±0.13

2.36±0.13

2.36±0.22

2.50±0.25

2.50±0.20

2.43±0.25

Brucella

abortus

7

2.29±0.18

2.14±0.14

2.14±0.14

2.29±0.29

2.14±0.26

2.14±0.14

2.29±0.18

8

2.00±0.31

1.86±0.34

2.00±0.00

2.00±0.22

2.14±0.26

1.86±0.26

2.00±0.31

 7,8

2.14±0.18

2.00±0.18

2.07±0.07

2.14±0.18

2.14±0.18

2.00±0.15

2.14±0.06

( ±S ) – средняя и ее средняя квадратическая ошибка, %

 

( ±S ) – middle and her quadratic error, %

 

Более того, оба этих показателя не отличаются от длительности подсчета ЛфР в положительных пробах при иммунореагенте на синтетическом сорбенте (14,6±0,1 мин). Статистически значимое сокращение времени подсчета результата при наличии ЛфР в пуле лимфоцитов имеет место у 5 из 5 больных, а при отсутствии ЛфР даже незначительное снижение зарегистрировано существенно (P=3,9∙10-4) реже – у 1 из 15 больных.

 

Таблица 7. Хронометраж подсчета результатов теста выявления ЛфР у 20 больных с подозрением на бруцеллез
Table 7. Chronometry of results count of LfR revealing in 20 patients suspected of having brucellosis

Показатели

 

Indicators

Подтверждение диагноза по тесту ЛфР

 

Confirmation of diagnosis witnLfR test

ЛфР(+)LfR(+)

ЛфР(-) (LfR-)

Р2

Количество пациентов

 

Quantity of patients

5

15

 

Среднее содержание ЛфР ( ±S ),%, при сорбенте: эритроцитарном

 

Middle content of LfR ( ±S ) % at sorbent:

erythrocyte

 

 

 

 

4.11±0.21

 

 

 

 

0

 

cинтетическом

 

synthetic

5.05±0.31

0

 

Р1

0.05>Р>0.02

-

 

Средняя длительность подсчета результата ( ±S ), % сек при сорбенте: эритроцитарном

 

Middle duration of result count ( ±S ), % sec at sorbent: erythrocyte

 

 

 

 

1210±76

 

 

 

 

881±8

 

 

 

 

<<0.001

синтетическом

 

sinthetic

875±3

871±7

0.8>Р>0.7

Р1 P1

0.01>Р>0.001

0.4>Р>0.3

 

Средняя кратность сокращения затрат времени на подсчет результата при замене сорбента на синтетический

 

Middle fold of decrease of time spending at change of sorbent to synthetic

 

 

 

 

 

1.4±0.1

 

 

 

 

 

1.012±0.006

 

 

 

 

 

<<0.001

Затрата времени ( ±S ), сек., на выявление одного ЛфР при сорбенте: эритроцитарном

 

Timespending ( ±S ), secforrevealing 1 LfRatsorbent:

erythrocyte

 

 

 

 

42.2±1.4

 

 

 

 

-

 

 

 

 

-

синтетическом

 

synthetic

25.1±1.9

-

-

Р1

<<0.001

 

 

( ±S ) – средняя и ее средняя квадратическая ошибка; 

Р1 – вероятность нуль-гипотезы при сравнении показателей при различных сорбентах;

Р2 – вероятность нуль-гипотезы при сравнении показателей при выявлении и отсутствии ЛфР.

 

( ±S ) – middle and her quadratic error;

P1 – probability of the zero-hypothesis at comparison of indicators at different sorbents;

P2 – probability of the zero-hypothesis at comparison of indicators at revealing and absence of LfR.

Таким образом, сокращение времени подсчета результата вследствие применения синтетического сорбента обусловлено затратами времени на визуальное определение ЛфР. Интегральным показателем для сравнения быстроты выявления ЛфР может служить время, затрачиваемое на визуальное обнаружение одного ЛфР. Оказалось, что при использовании иммунореагента на основе эритроцитарного сорбента на это затрачено от 38 до 45, в среднем 42,2±1,4 секунды, а при использовании иммунореагента на основе синтетического сорбента – от 22 до 32, в среднем – 25,1±1,9 секунды, то есть в 1,7 раза меньше. Приведенный рисунок 1 показывает, что это преимущество обусловлено более легким выявлением ЛфР при использовании иммунореагента на синтетическом сорбенте.

1– лимфоцит (8 мкм), не связавший >2 корпускул иммунореагента; 2 – лимфоцит (8 мкм), связавший >2 корпускул иммунореагента (ЛфР); 3 – эритроцитарныйиммунореагент (4 мкм); 4 – синтетический иммунореагент (2 мкм)
Рис. 1.Обнаружение ЛфР при использовании реагентов на основе эритроцитарного (А) и синтетического (B) сорбентов
1 – lymphocyte (8 µm) notbinding>2 corpuscleofimmunologicreagent; 2 – lymphocyte (8 µm) binding>2 corpuscleofimmunologic reagent (LfR); 3 – erythrocyte immunologic reagent (4µm); 4 – synthetic immunologic reagent (2 µm).
Fig. 1. Revealing of ABL at use of reagents on the bases the erythrocyte (A) and synthetic (B) sorbents
 
1– лимфоцит (8 мкм), не связавший >2 корпускул иммунореагента; 2 – лимфоцит (8 мкм), связавший >2 корпускул иммунореагента (ЛфР); 3 – эритроцитарныйиммунореагент (4 мкм); 4 – синтетический иммунореагент (2 мкм)
Рис. 1.Обнаружение ЛфР при использовании реагентов на основе эритроцитарного (А) и синтетического (B) сорбентов
1 – lymphocyte (8 µm) notbinding>2 corpuscleofimmunologicreagent; 2 – lymphocyte (8 µm) binding>2 corpuscleofimmunologic reagent (LfR); 3 – erythrocyte immunologic reagent (4µm); 4 – synthetic immunologic reagent (2 µm).
Fig. 1. Revealing of ABL at use of reagents on the bases the erythrocyte (A) and synthetic (B) sorbents

 

Полученные результаты обосновывают целесообразностьзамены эритроцитарного на синтетический сорбент в иммунореагентах, предназначенных для определения ЛфР, специфичных к ЛПС бруцелл и, вероятно, к ЛПС возбудителей других инфекций.

 

ВЫВОДЫ

 

1. Синтетический сорбент, не нагруженный антигеном, в отличие от эритроцитарного, не взаимодействует с лимфоцитами иммунизированных животных и больных людей. Применение синтетического сорбента вместо эритроцитарного в иммунореагентах для выявления лимфоцитов с рецепторами к антигену позволяет повысить специфичность теста определения ЛфР и исключить параллельный тест с сорбентом, не нагруженным антигеном.

2. Замена эритроцитарного сорбента на синтетический не отменяет обусловленного таксономическими связями ЛПС бруцелл и Y. enterocoliticaсеровара О9 взаимодействия, хотя иболее слабого, разработанных бруцеллезных ЛПСиммунореагентов с лимфоцитами, имеющими рецепторы для ЛПС бруцеллсЛПС Y.enterocoliticaO9.

3. Замена в иммунореагентах эритроцитарного сорбента на синтетический позволяет ускорить выполнение подсчета ЛфРв положительных пробах почти в 3 раза за счет исключения теста с контрольным иммунореагентом и более простым выявлением ЛфР микроскопическим методом. 

 

 

Финансирование

Работа выполнена по гранту №4187/ГФ4от 01.04.2015 г. Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан.

 

REFERENCES

 

  1. Karalnik B.V., Denisova T.G.,Gruschina T.A. et al. Nabo rreagentov dlya immunologicheskoy diagnostiki brucellosa i sposob diagnostiki brucellosa//Prеdpatent RK №14578 [Set of reagents for immunologic brucellosis diagnostics and method of brucellosis diagnostics] Predpatent RK №14578: In: Industry property. Official bulletin.Almaty,2004, no.7,pp. 7-10.
  2. Karalnik B.V.,Denisova T.G.,Gruschina T.A., Tugambayev T.I. Analyz immunnogo otveta morskych svinok, inficirovannich B.melitensis [Analysis of immune response of infected by Brucella melitensisguinea pigs.]. Z.mikrobiologiyi–J. microbiology, M., 2002, no.2, pp. 52-56.
  3. Karalnik B.V., Denisova T.G. Metod viyavleniya antigensvyazivayuschich limfocitov [Method of antigen binding lymphocytes revealing]. In: Klinicheskiye aspekty. Almaty, 2002,pp. 14-24.
  4. Karalnik B.V.,Denisova T.G.,Zunusova G.B., et al. Effektivnost razlichnych reakciy opredeleniya antitel i testa antigensvyazivayuschich limfocytov v diagnostike brucellosa u lyudey [Efficacy of different tests of antibodies determination and test of antigen binding lymphocytes in brucellosis diagnostics at people]. Medizinskaya Immunologiya. – Medical Immunology, Sankt-Peterburg, 2006,vol.8, no.4,pp. 74-78.
  5. Mamutova А.М., KadyrovaSch.А., Zankin А.А., et al. Opredeleniye antigensvyazyvayuschich limfocitov pri ostrom I podostrom brucellose [Antigen binding lymphocytes determination at acute and subacute brucellosis]. Gigiyena,epidemiologiya i immunobiologiya – Gigiene, epidemiology and immunobiology,Almaty, 2007, no.1,pp. 109-113.
  6. Schamardyn V.A., Karalnik B.V. Zavisimost blokirovaniya poverchnosti erithrocita ot kolichestva svyazannich v processe hemosensibilizacii molekul IgG [Addiction of blocking of erytrocyte surface from quantity of binding IgG molecules]. Z.mikrobiologii – J. Microbial, М., 1976, no.12, pp.81-85.
  7. Westphal O., Lϋderitz O., Bister F. Ueber die Extraktion von Bakterien mit Phenol-Waser.Z.Naturforsch., 1952, Bd.76, pp.148-155.
  8. Karalnik B.V.,Schamardyn V.A.,Schmuter M.F.Sravnitelnaya ocenka stabilizacii eritrocitov dlya reakcii passivnoy hemagglutinacii formaldehidom i acetaldehidom [Comparative estimation of erythrocyte stabilization for haemagglutination reaction by formaldehyde and acetaldehyde ]. Vacciny isivorotki – Vaccines and sera,М.,1973, no.20, pp. 122-126.
  9. Karalnik B.V., Leschinskaya L.Ch. Sposob polucheniya immunoreagenta [Method of immunological reagent preparation]. АSSSSR 862919. Bull. izobreteniy.,М., 1981, no.34, pp. 30.
  10.  Nielsen K.H., Wright P.F., Kelly W.A.,Cherwonogrodzky J.H. A review of enzyme immu-noassay for detection of antibody to Brucella abortusin cattle.Vet. Immunol.Immunopathol., 1988, vol.18, no.4, pp.331-347.
  11. Differencialnaya diagnostika brucellosa i yersinioza i merypoichprofilaktike [Differential diagnostics of brucellosis and yersiniosis]: Мetodicheskie rekomendacii. Мinisterstvo selskogo chozyajstva i prodovolstviya RSFSR – Methodical recommendations. Ministry of agriculture and food of RSFSR.М.,1991, 14 p.
  12. SmirnovI.V. Sposob differenciacii yersiniy serovaraО9 otbrucell [Method of differentiation of Yersinia, serovar O9 from Brucella]. PatentRF№1703119.
  13. Karalnik B.V., Studenzova V.K., Bulaschev A.K., Dmitriev A.F., Mukanov K.K. Brucellozniy antitelni yerithrocytarniy diagnosticum iz monoklonalnich antitel [Brucella antibody erythrocyte diagnosticum from monoclonal antibodies]. Z.mikrobiologii – J. microbial,М.,1991, no.4, pp.63-66.
  14. Karalnik B.V., Karabekov A.Z.,Denisova T.G., et al.Differencialnaya diagnostika brucelloza i kischechnogo iersinioza, vizvannogoY.enterocolitica O9 [Differential diagnostics of brucellosis and intestinal yersiniosis caused byY.enterocolitica O9]. Мedicina – Medicine,Almaty, 2004, no.3, pp. 155-157.​

 

БРУЦЕЛЛАЛАРДЫҢ ЛИПОПОЛИСАХАРИДТЕРІНЕ РЕЦЕПТОРЛАРЫ БАР ЛИМФОЦИТТЕРДІ АНЫҚТАУ ҮШІН СИНТЕТИКАЛЫҚ ЖӘНЕ ЭРИТРОЦИТАРЛЫҚ СОРБЕНТТЕР НЕГІЗІНДЕ ЖАСАЛЫНҒАН ДИАГНОСТИКАЛЫҚ РЕАГЕНТТЕРДІ САЛЫСТЫРМАЛЫ БАҒАЛАУ

 

Каральник Б.В.1, Денисова Т.Г.1, Омарова М.Н.1, Жунусова Г.Б.1, Тугамбаев Т.И.2, Закарян С.Б.2,Федосов Ю.С.1
1Х. Жұматов атындағы Гигиена және эпидемиология ғылыми орталығы
М.Мақатаев көш., 34, Алматы, 050002, Қазақстан
2М.Айқымбаев атындағы Қазақ карантиндік және зооноздық жұқпалар ғылыми орталығы
Капальская көш., 14, Алматы, 050054, Қазақстан
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ТҮЙІН

Жұмыс мақсаты – бруцеллезді ерте анықтау үшінсинтетикалық сорбент негізінде имуннореагент дайындаумен науқастарды зерттегенде және жануарлардға егу тәжірибелерінде бұрын жасалынған эритроцитарлы иммунореагантпен салыстыру. Жұмыста қояндар, ірі және ұсақ қара малға арналған малдәрігерлік бруцеллезді вакциналар, бруцеллалармен иерсиниялардын әртүрлі липополисахаридтері (ЛПС), флуорохронмен (изотиоцианат натрия) белгіленген және белгіленбеген

( -NH2 немесе -COOH топтармен) химиялық белсендірілген диаметрі 2 мкм полистеролды моншақтар (beads), антигенге рецепторлары (ЛфР) бар лимфоциттерді анықтайтын ертеде жасалынған бруцеллезді эритроцитарлы иммунореагент, бруцеллезға күмәні бар науқастар және егілген қояндардын мононуклеарлы фракциялары.

Жасушалар/корпускулалардыадгезиялау және оларды ЛПС-пен оқшаулау, ЛфР санау хронометражі, серияларды статистикалық салыстыру әдістері қолданылған. Синтетикалық сорбент негізінде бруцеллезді иммунореагент жасалынды және бруцеллезді эритроцитарлы иммунореагентпен салыстырғанда оның артықшылықтары анықталды: ЛПС емес сорбентпен байланысу арқасында спецификалық емес адгезиясы жок және ЛфР анықтаудың жоғары дәлдігі; лимфоциттерді сорбентпен байланыстырудын паралельді анықтауынын қажеті жоқ; ЛфР санауға уақыт азаяды және жеңілдетіледі. Сорбенттің ерекшеліктеріЛПС-қа таксономиялық жақын бактериялары ЛфР анықтауға әсер етпейді. Алынған нәтижелер синтетикалық сорбентте жасалынған ЛфР анықтайтын иммунореагентті қолдану орындылығын негіздейді.

Негізгі сөздер: сорбенттелген иммунореагенттер, ерте диагностика, бруцеллез.