3/2015

УДК 577.083.185

 

ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ГРИБА TRICHODERMA HARZIANUM В1

 

Умаров Б.Р.1, Сагдиев Н.Ж.2, Ким А.Л.2, Инагамов У.К.2
1Институт микробиологии АН РУз
ул. А. Кадыри, 7б, Ташкент, 100128, Узбекистан
2Институт биоорганической химии им. А.С. Садыкова АН РУз.
ул. Мирзо Улугбека, 83, Ташкент, 100125, Узбекистан
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

АБСТРАКТ

В условиях глубинного культивирования на среде с 2%-ными пшеничными отрубями, как единственным источником углерода, на качалке при 200 об/мин., при температуре 30±1оС в течение 5 суток местный штамм Trichoderma harzianum В1 продуцировал целлюлолитические ферменты. В культуральной жидкости изучены внеклеточные белки и ферменты целлюлазного комплекса. Выделены и очищены целлюлолитические ферменты с помощью хроматографии разных систем и разными гель-носителями на сефадексе G-75, Акрилекс П-60 и на ионообменной хроматографии ДЭАЭ Тойперл 650М геле. Молекулярная масса выделенных белков и ферментов определена с помощью электрофореза на 12% ПААГ в присутствии 0,1% SDS с использованием маркерных белков с известными молекулярными массами. Молекулярная масса трёх изоформ эндо-1,4-β-глюканазы (EC 3.2.1.4), EG 1, EG 2 и EG 3 соответствовала ММ 35±1 кДа, с целлюлолитической активностью 90,4, 77,52 и 78,92 ед/мг белка, а молекулярная масса четырёх изоформ целлобиазы (1,3-β-глюкозидазы, EC 3.2.1.21), CBH 1, CBH 2, CBH 3 и CBH 4 соответствовала ММ 24±1 кДа, с целлюлолитической активностью 2,60, 3,80, 4,3 и 3,0 ед/мг белка. Изучено влияние температуры, рН среды и ионов металлов на целлюлолитическую активность и стабильность изучаемых ферментов. Оптимальные температуры эндо-1,4-β-глюканазы и целлобиазы (1,3-β-глюкозидазы) были равны 50оС и рН в пределах 4,8. Эффект одно- и двухвалентных ионов металлов K, Na, Fe, Mg и Mn в буферной среде увеличили активность ферментов 1,4-β глюканазы на 10%, и 1,3-β глюкозидазы на 15%.

Ключевые слова: Trichoderma harzianum В1, изоформы эндо-1,4-β-глюканазы, 1,3-β-глюкозидазы.

 

ISOLATION OF CELLULOLYTIC ENZYMES FROM THE FUNGUS TRICHODERMA HARZIANUM В1

 

Umarov B.R. 1, Sagdiev N.G.2, Kim A.V.2, Inagamov U.K.2
1Institute of Microbiology, Academy of Sciences of Uzbekistan
7b, A. Kadyri str., Tashkent, 100128
, Uzbekistan
2 A.S. Sadykov Institute of Bioorganic Chemistry, Academy of  Sciences of the Republic of Uzbekistan
83, M. Ulugbek str., Tashkent, 100125
, Uzbekistan
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ABSTRACT

The local strain of Trichoderma harzianum В1 produces cellulolytic enzymes when cultured submerged in a medium containing 2% wheat bran as the sole carbon source. Chromatography systems using different carriers and different matrices, including Sephadex G-75, P-60 Akrileks, and ion exchange chromatography on DEAE 650M gel Toyperl, were used to isolate three isoforms of endo-1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.4), EG 1, EG 2, and EG 3 and determined a molecular weight (MW) of 35±1 kDa. The isolates exhibited a cellulolytic activity of 90.4, 77.52, and 78.92 U/mg protein. In addition, we isolated four isoforms of cellobiase (1.3-β-glucosidase, EC 3.2.1.21) CBH 1, CBH 2, CBH 3, and CBH 4 with aMW 24±1 kDa, and a cellulolytic activity of 2.60, 3.80, 4.3, and 3.0 U/mg protein. The influence of the temperature, pH, and metal ions on the activity was determined for the cellulolytic enzymes. The optimal pH and temperature of endo-1,4-β-glucanase and cellobiase (1,3-β-glucosidase) was observed to bepH 4.8 and 50°C. The effect of the monovalent and divalent metal ions K, Na, Fe, Mg, and Mn in a buffered medium increased the enzymatic activity of 1,4-β-glucanase by10%, and of 1,3-β-glucosidase by 15%.

Keywords: Trichoderma harzianum В1, cellulolytic enzymes, endo-1,4-β-glucanase, 1,3-β-glucosidase


 

ВВЕДЕНИЕ

Целлюлазы (целлюлолитические ферменты) – ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз 1,4-гликозидных связей в молекуле целлюлозы с образованием набора олигосахаридов различной степени полимеризации вплоть до мономера – глюкозы. Различают два основные типа целлюлазы: 1) эндоглюканазы (1,4-глюкан-4-глюканогидролазы, эндо-1,4-глюканазы); 2) целлобиогидролазы (1,4-D-глюкан-4-целлобиогидролазы, экзоцеллобиогидролазы) [1]. Эти два типа целлюлазы отличаются по характеру действия на молекулы целлюлозы и, как правило, действуют совместно. Целлюлазы первого типа гидролизуют связи в молекуле целлюлозы и некоторых ее растворимых производных (карбоксиметил-, гидроксиэтилцеллюлоза и др.). Целлюлазы второго типа гидролизуют молекулы целлюлозы, образуя почти исключительно целлобиозу, которую они отщепляют с невосстанавливающегося конца полисахарида (п – число звеньев цепи). Характерное свойство двух типов целлюлазы – наличие синергизма (взаимного усиления) при их совместном действии на высокоупорядоченные формы целлюлозы (хлопковое волокно, микрокристаллическая целлюлоза) [2]. Ферментные системы грибов содержат, как правило, множественные формы обеих форм целлюлазы, отличающиеся молекулярной массой, изоэлектрической точкой и содержанием ковалентно связанных углеводных остатков [3]. Часть целлюлазы – истинные изоферменты, кодируемые самостоятельными генами, другие формы образуются при посттрансляционной модификации основных типов целлюлазы. Ферментативная деструкция целлюлозы происходит, как правило, под действием не отдельных ферментов, а полиферментных систем (комплексов) [4]. Ферментам этих систем присущи определенная специализация: одни из них эффективно гидролизуют «внутренние», а другие предпочтительно расщепляют «внешние» гликозидные связи, находящиеся на концах полисахаридной молекулы (экзодеполимеразы, экзоглюканазы, экзоферменты). Глюкозидазы осуществляют гидролиз гликозидных связей ди- и олигосахаридов [5].

Целью настоящей работы являлось выделение и изучение целлюлолитических ферментов эндо-1,4-β-глюканазы (EC 3.2.1.4) и целлобиазы (1,3-β-глюкозидазы) (КФ 3.2.1.21) у местных штаммов грибов T. harzianum В1, выращенных в условиях глубинного культивирования.

 

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штамм и условия культивирования. Объектом исследования служил штамм гриба T. harzianum В1, продуцент целлюлолитических ферментов, полученный из коллекции Института микробиологии АН РУ. Выращивание штамма T. harzianum В1 проводили в глубинных условиях на среде Мендельса [6]. В качестве источника углерода использовали 2%-ные пшеничные отруби. Ферментацию проводили на качалке при 200 об/мин., температуре 30±1oС в течение 5 суток.

Определение белка. Для изучения внеклеточных белков и ферментов целлюлазного комплекса использовали культуральную жидкость (КЖ), насыщенную до 80% солями сульфата аммония. Концентрацию общего белка определяли по методу Мериона Бредфорда [7].

Выделение и очистка целлюлолитических ферментов. Хроматографическое выделение индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса штамма T. harzianum В1 проводили с помощью системы хроматографии на приборе «Uvicord» (LKB Швеция), состоящем из автоматического контроллера процесса, насоса, ультрафиолетового проточного детектора и коллектора фракций.

Гель-фильтрацию высокомолекулярного белка проводили на колонке (2,5х90 см) с сефадексом G-75, уравновешенной 0,05 М натрий-ацетатным буфером, pH 4,75 и Акрилексом П-60, уравновешенной 0,05 М натрий-бикарбонатным буфером.

Ионообменную хроматографию проводили на ДЭАЭ Тойперл 650 М геле «Toya Soda» (Япония) на колонке (1,5x15 см), уравновешенной 0,01 М аммоний гидрофосфатным буфером и элюировали связавшийся белок в градиенте с натрием хлором от 0 до 1,5 М в течение 10 часов.

Определение активности ферментов. Эндоглюканазная активность была определена действием фермента на КМЦ: 0,5 мл 1%-ного раствора Na КМЦ в 0,05 М натрий цитратном буфере (рН 5,5) и 0,5 мл ферментного раствора в культуральной жидкости по методу Сомоджи-Нельсона [8].

β-глюкозидазную активность определяли путем измерения увеличения содержания редуцирующих сахаров, образовавшихся под действием ферментов на целлобиозу.

Определение молекулярной массы. Молекулярную массу разделенных ферментов (кДа) определяли с помощью электрофореза. Электрофорез белка проводили по прописи Лэмли [9] на 12% ПААГ в присутствии 0,1% SDS с использованием маркерных белков с известными молекулярными массами в буфере «MES» (Sigma Aldrich). В качестве стандартов использовали маркерный белок «BLUeye Prestained Ladder» 8-240 кДа фирмы «Gene Direx».

Влияние температуры и рН. Активность 1,4-β-глюканазы и 1,3-β-глюкозидазы исследовали в пределах температуры 30…80oС и рН среды 3-10, используя стеклянную пробирку со шлифованной пробкой, в 50 мМ ацетатного буфера.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы было изучено определение целлюлолитической активности ферментативного комплекса из КЖ штамма T. harzianum В1. Ферментативная активность на 5 сутки ферментации в 1000 мл среде достигла максимума 5,3 ед/мг субстрата. Для концентрирования объема белкового раствора из 1000 мл супернатанта КЖ использовали лиофилизованную сушку. Высушенный препарат КЖ был растворен в 100 мл дистиллированной воды. Для осаждения белков использовали аммоний сульфат до 80% насыщения. Осажденные белки растворяли в 15 мл 0,01 М ацетатного буфера, pH 4,75.

Выделение фермента эндо-1,4-β-глюканазны (EC 3.2.1.4). Фермент был получен с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке размером 2,5х90 см, заполненной сефадексом G-75 и уравновешенной 0,01 М натрий ацетатным буфером, pH 4,75, на приборе «Uvicord» (LKB Швеция) при комнатной температуре в течение 10 часов, скорость потока 60 мл/ч (рис. 1).

Рис. 1. Гель-фильтрация и обессоливание внехромосомных белков КЖ T. harzianum B1
Объем фракции 5 мл. Стрелками указаны КМЦ активные фракции

Fig. 1. Gel filtration and desalting of proteins extrachromosomal Cultural liquid of T. harzianum B1
Fractions of 5 mL volume. The arrows indicate the CMC active fractions
 
Рис. 1. Гель-фильтрация и обессоливание внехромосомных белков КЖ T. harzianum B1
Объем фракции 5 мл. Стрелками указаны КМЦ активные фракции

Fig. 1. Gel filtration and desalting of proteins extrachromosomal Cultural liquid of T. harzianum B1
Fractions of 5 mL volume. The arrows indicate the CMC active fractions

 

Как видно из рисунка 1, при разделении концентрата обнаружены две белковые фракции. Эндо-1,4-β-глюканазная активность проявлялась на подъёме 90,4 ед/мг белка и спуске первого пика двумя активностями 77,52 и 78,92 ед/мг белка. Разделенные три ферментные фракции в объемах 5 мл по ферментативной активности были соответственно в 14 раз выше в полученном, чем в исходном объеме (1000 мл). Фракции №10, №23 и №25, обладающие КМЦ (эндо-1,4-β-глюканазными) активностями, были отмечены как изоформы этих ферментов EG 1, EG 2, и EG 3. Далее объемы этих фракций с активностью эндо-1,4-β-глюканазы были сконцентрированы с помощью лиофилизации до 200 мкл объема и использованы в дальнейших исследованиях. При электрофорезе разделенные ферментные препараты имели ММ приблизительно одинакового размера 35±1 кДа (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма КМЦ активных фракций 
1 – маркер; 2, 3, 4 – фермент эндо-1,4-β-глюканаза 1, 2, 3

Fig. 2. Electrophoregram of CMC active fractions 
1 – marker; 2, 3, 4 – enzyme endo-1,4 β-glucanase 1, 2, 3
 
Рис. 2. Электрофореграмма КМЦ активных фракций 
1 – маркер; 2, 3, 4 – фермент эндо-1,4-β-глюканаза 1, 2, 3

Fig. 2. Electrophoregram of CMC active fractions 
1 – marker; 2, 3, 4 – enzyme endo-1,4 β-glucanase 1, 2, 3

 

Полученные после гель-фильтрации три изоформы целлюлазного фермента обладали эндо-1,4-β-глюканазной активностью с одинаковыми молекулярными массами 35±1 кДа. По литературным данным, молекулярная масса грибных эндоглюканаз находится в диапазоне 11-100 кДа, наиболее распространенные эндоглюканазы имеют молекулярную массу 30-55 кДа [10]. Бактериальные эндоглюканазы, как правило, несколько больше грибных и их молекулярные массы выше 65 кДа [11, 12]. Эндоглюканазы, как и другие компоненты целлюлазных комплексов, имеют множественные формы, отличающиеся по молекулярной массе, составу углеводной части, значению изоэлектрической точки, а также молекулярной активности и термостабильности [13]. В одном из наиболее изученных целлюлазных комплексов, продуцируемого микромицетом Trichoderma viride, обнаружено пять эндоглюканаз и две целлобиогидролазы. Около 30 множественных форм обнаружено у штамма Trichoderma reesei [14]. Множественные формы отмечены у целлюлаз других микроорганизмов, а также у целлюлаз из высших растений [15, 16]. Биологическая роль и причины наличия множественных форм целлюлолитических ферментов до конца не выяснены. Из литературных данных известно, что эндоглюканазам принадлежит важнейшая роль в действии полиферментных систем, поскольку они первыми атакуют целлюлозу. Гидролиз гликозидных связей эндоглюканазами протекает с сохранением конфигурации расщепляемой связи и может сопровождаться трансгликозилированием [17]. Действие эндоглюканаз характеризуется резким уменьшением степени полимеризации (СП) полисахаридных субстратов (уменьшение вязкости растворимых производных целлюлозы), в результате чего могут образоваться низкомолекулярные продукты моно-, ди- и трисахариды [18].

Второй этап нашей работы состоял в выделении фермента целобиазы (1,3-β-глюкозидазы) из 800 мл КЖ T. harzianum В1.

Выделение 1,3-β-глюкозидазы. 5-суточную КЖ фильтровали через стеклянный фильтр и центрифугировали при 3000 g в течение 30 мин (К-23, Германия), осадок отбросили, супернатант повторно центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин (К-24, Германия). Очищенный прозрачный супернатант в объеме 600 мл был концентрирован с помощью лиофолизованной сушки, растворен в объеме 60 мл и использован для дальнейших работ. Хроматографию проводили на колонке размером 2,5х90 см, заполненной Акрилексом П-4, уравновешенной 0,01 М натрий ацетатным буфером pH 4,75 на приборе «Uvicord» (LKB, Швеция) при комнатной температуре в течение 10 часов, скорость потока 60 мл/ч. Высокомолекулярная фракция белков (рис. 3, пик 1) обладала 1,3-β-глюкозидазной активностью. Количество белка определяли по методу Мэрион Бредфорда [7]. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (рис. 3).

Рис. 3. Гель-фильтрация и обессоливание внехромосомных белков КЖ T. harzianum B.1 
Элюция с аммиачным буфером рН 6,0, скорость элюции 60 мл/ч, объем фракции 5 мл; 
1 – пик, высокомолекулярная белковая фракция с целлюлолитической активностью
 

Fig. 3. Gel filtration and desalination extrachromosomal proteins cultural liquid T. harzianum B.1
Elution with ammonia buffer pH 6,0, the elution rate of 60 ml/h, fractions of 5 ml volume; 
1 – Peak, high molecular weight protein fraction with cellulolytic activity
 
Рис. 3. Гель-фильтрация и обессоливание внехромосомных белков КЖ T. harzianum B.1 
Элюция с аммиачным буфером рН 6,0, скорость элюции 60 мл/ч, объем фракции 5 мл; 
1 – пик, высокомолекулярная белковая фракция с целлюлолитической активностью 
 

Fig. 3. Gel filtration and desalination extrachromosomal proteins cultural liquid T. harzianum B.1
Elution with ammonia buffer pH 6,0, the elution rate of 60 ml/h, fractions of 5 ml volume; 
1 – Peak, high molecular weight protein fraction with cellulolytic activity

 

Объединенная высокомолекулярная белковая фракция с 1,3-β-глюкозидазной активностью в объеме 60 мл была использованы для рехроматографического разделения на гель носителе Акрилекс П-60. Рехроматографию объединенной фракции проводили на колонке (2,5х90 см) с Акрилексом П-60 «Reanal» (Венгрия), уравновешенной аммиачным буфером рН 6,0 при скорости элюции 60 мл/час, объем фракции 5 мл, при 280 нм поглощения. Объединенные фракции в объеме 125 мл имели 1,3-β-глюкозидазную активность 8,4 ед/мг белка. Объединенные фракции были сконцентрированы с помощью лиофилизации. Белковый препарат был растворен в 5 мл буферном растворе и таким образом был в 12 раз сконцентрирован объем обессоленных белковых фракций.

Ионообменную хроматографию ферментного раствора объединенной фракции (рис. 4) проводили на ДЭАЭ Тойперл 650М геле, как описано ранее. Нанесение раствора обессоленного фермента на колонку и связывание белков с носителем контролировали на приборе «Uvicord» (LKB, Швеция). Скорость элюции составляла 60 мл/ч, объем фракции 5 мл, время элюции 7 часов. После нанесения обессоленного раствора фермента на колонку связавшиеся белки отмывали стартовым буфером. Элюирование связавшихся белков из носителя проводили в линейном градиенте NaCl 0-1М, в течение 4 часов. На этом этапе удалось получить две белковые фракции. При дальнейшем увеличении концентрации буфера до 1,5М в течение 3 часов удалось получить ещё 2 белковые фракции. Профиль элюции белков с колонки представлен на рисунке, из которого видно, что связавшиеся белки вымывались только в линейном градиенте NaCl (рис. 4).

Рис. 4. Ионообменная хроматография объединенной фракции, проявившая 1,3-β-глюкозидазную активность на колонке (1,5х15 см) в линейном градиенте 0-1,5М NaCl 
Пики 1, 2, 3, 4, обладающие 1,3-β-глюкозидазной активностью

Fig. 4. Ion-exchange chromatography combined fractions, showed 1,3-β-glucosidase activity column (1,5x15 cm) in a linear gradient of 0-1,5M NaCl 
1, 2, 3, 4 peaks having 1,3-β-glucosidase activity
 
Рис. 4. Ионообменная хроматография объединенной фракции, проявившая 1,3-β-глюкозидазную активность на колонке (1,5х15 см) в линейном градиенте 0-1,5М NaCl 
Пики 1, 2, 3, 4, обладающие 1,3-β-глюкозидазной активностью

Fig. 4. Ion-exchange chromatography combined fractions, showed 1,3-β-glucosidase activity column (1,5x15 cm) in a linear gradient of 0-1,5M NaCl 
1, 2, 3, 4 peaks having 1,3-β-glucosidase activity

 

Во всех разделенных фракциях определяли целлюлолитическую активность к субстрату целлобиозу. Разделенные 4 белковые фракции обладали целлобиазной (1,3-β-глюкозидаза) активностью и обозначены как CBH-1, CBH-2, CBH-3 и CBH-4. Все 4 фракции имели удельную активность 2,60, 3,80, 4,3 и 3,0 ед/мг белка, соответственно. Содержание общего белка в каждой фракции составляло 805, 1300, 1500 и 1100 мкг/мл, что намного ниже ожидаемого. Все фракции, обладавшие целлобиазной (1,3-β-глюкозидазной) активностью, в объеме 5 мл были сконцентрированы путем лиофилизации и растворены в объеме 200 мкл.

SDS электрофорез проводили по методу Лэммли [9], как было описано ранее. По подвижности в сравнении со стандартными белками ферменты CBH-1, CBH-2, CBH-3 и CBH-4 имели молекулярную массу близкую к одинаковым размерам 24±1 кДа (рис. 5).

Рис. 5. Электрофореграмма целлобиаза активных фракций 
1 – маркер; 2, 3, 4, 5 – фермент 1,3-β-глюкозидазы 1, 2, 3, 4 

Fig. 5. Electrophoregram of cellobiase active fractions 
1 – marker; 2, 3, 4, 5 – enzyme 1,3-β-glucosidase activity 1, 2, 3, 4
 
Рис. 5. Электрофореграмма целлобиаза активных фракций 
1 – маркер; 2, 3, 4, 5 – фермент 1,3-β-глюкозидазы 1, 2, 3, 4 

Fig. 5. Electrophoregram of cellobiase active fractions 
1 – marker; 2, 3, 4, 5 – enzyme 1,3-β-glucosidase activity 1, 2, 3, 4

 

Эти данные свидетельствуют о том, что при подобранных условиях штамм T. harzianum В1 способен синтезировать множество молекулярных форм 1,3-целлобиазы. Известно, что целлобиазы – это разновидность β-глюкозидаз, обладающих узкой специфичностью и гидролизующих только целлобиозу. Целлобиазы гидролизуют целлобиозу с сохранением аномерной конфигурации агликона, причем гидролиз, как правило, сопровождается трансгликозилированием [19, 20]. Молекулярная масса целлобиаз варьирует в широких пределах, например, в гомогенном состоянии получены целлобиазы с молекулярной массой около 50 кДа и молекулярной массой 100-300 кДа. Многие β-глюкозидазы способны гидролизовать, наряду с целлобиозой, также и олигосахариды с более высокой СП. Причем обычно их каталитическая активность уменьшается с увеличением длины олигосахарида. Следует отметить, что трансгликозилирование обычно проявляется в заметной степени при достаточно высоких концентрациях акцептора [21, 22].

Одной из важных характеристик ферментных препаратов являются рН и температурные оптимумы целевой активности, а также их стабильность при различных параметрах. Эти параметры во многих случаях являются ключевыми при выборе ферментов для различных биотехнологических процессов. Влияние температуры и рН среды на активность ферментов 1,4-β-глюканазы и 1,3-β-глюкозидазы в субстратах КМЦ и целлобиозы было исследовано в пределах температуры от 30оС до 80оС, при рН среды 3,0-10,0, при использовании 50 мМ ацетатного буфера. Максимальная активность и стабильность ферментов 1,4-β-глюканазы и 1,3-β-глюкозидазы наблюдалась при рН 3,0-5,0. Из рисунков 6 и 7 видно, что 1,4-β-глюканазы и 1,3-β-глюкозидазы проявляли максимальную активность при рН 4,8. 

Рис. 6. Влияние рН среды на ферментативную активность 1,4-β-глюканазы 1, 2, 3
Fig. 6. Effect of pH on enzyme activity 1,4-β-glucanase 1, 2, 3
 
Рис. 6. Влияние рН среды на ферментативную активность 1,4-β-глюканазы 1, 2, 3
Fig. 6. Effect of pH on enzyme activity 1,4-β-glucanase 1, 2, 3

 

Рис. 7. Влияние рН среды на ферментативную активность 1,3-β-глюкозидазы 1, 2, 3, 4
Fig. 7. Effect of pH on enzyme activity of 1,3-β-glucosidase 1, 2, 3, 4
 
Рис. 7. Влияние рН среды на ферментативную активность 1,3-β-глюкозидазы 1, 2, 3, 4
Fig. 7. Effect of pH on enzyme activity of 1,3-β-glucosidase 1, 2, 3, 4

 

Влияние температуры на активность ферментов 1,4-β-глюканазы и 1,3-β-глюкозидазы проверяли при температуре 50оС в течение 4 часов. Уменьшение полной активности ферментов наблюдали после 30 мин при температурах 60-70оС (рис. 8 и 9).

Рис. 8. Влияние температуры на ферментативную активность 1,4-β-глюканазы 1, 2, 3
Fig. 8. Effect of temperature on enzyme activity of 1,4-β-glucanase 1, 2, 3
 
Рис. 8. Влияние температуры на ферментативную активность 1,4-β-глюканазы 1, 2, 3
Fig. 8. Effect of temperature on enzyme activity of 1,4-β-glucanase 1, 2, 3

 

Рис. 9. Влияние температуры на ферментативную активность 1,3-β-глюкозидазы 1, 2, 3, 4
Fig. 9. Effect of temperature on enzyme activity of 1,3-β-glucosidase 1, 2, 3, 4
 
Рис. 9. Влияние температуры на ферментативную активность 1,3-β-глюкозидазы 1, 2, 3, 4
Fig. 9. Effect of temperature on enzyme activity of 1,3-β-glucosidase 1, 2, 3, 4

В ряде случаев ионы металлов (Со2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+) выполняют функции простетических групп ферментов, или служат акцепторами и донаторами электронов, или выступают в качестве электрофилов либо нуклеофилов, сохраняя реактивные группы в необходимой ориентации. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-субстратного комплекса. Иногда металл соединяется с субстратом, образуя истинный субстрат, на который действует фермент. Эффект ионов металлов на целлюлолитическую активность ферментов 1,4-β-глюканазы и 1,3-β-глюкозидазы был изучен в присутствии одно- и двухвалентного ионов металлов K, Na, Fe, Mg и Mn. В буферной среде, содержащей ионы металлов до 10 мМ KCl, NaCl, FeSO4, MgSO4 и MnSO4, после инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре (при субстратах КМЦ и целлобиозы) активность ферментов 1,4-β-глюканазы увеличилась на 10%, 6,65 мкг/мл, а 1,3-β-глюкозидазы – на 15%, 6,95 мкг/мл (рис. 10 и 11).

Анализ изложенных в работе экспериментальных данных свидетельствует, что важнейшим условием биоконверсии является глубокая деструкция (осахаривание) обрабатываемого субстрата.

Рис. 10. Эффект ионов металлов на активность 1,4-β-глюканазы 1, 2, 3
Fig. 10. Effect of metal ions on activity of 1,4-β-glucanase 1, 2, 3
 
Рис. 10. Эффект ионов металлов на активность 1,4-β-глюканазы 1, 2, 3
Fig. 10. Effect of metal ions on activity of 1,4-β-glucanase 1, 2, 3

 

Рис. 11. Эффект ионов металлов на активность 1,3-β-глюкозидазы 1, 2, 3, 4
Fig. 11. Effect of metal ions on activity of 1,3-β-glycosidase 1, 2, 3, 4
 
Рис. 11. Эффект ионов металлов на активность 1,3-β-глюкозидазы 1, 2, 3, 4
Fig. 11. Effect of metal ions on activity of 1,3-β-glycosidase 1, 2, 3, 4

 

Таким образом, исследуемый штамм T. harzianum В1 обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных целлюлаз, включающий эндоглюканазы, целлобиазы (β-глюкозидазы), что создает возможность получения активного комплекса ферментов. При необходимости возможно получение отдельных индивидуальных ферментов, гидролизующих основные компоненты клеточной стенки растений, осуществляющих биодеградацию целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе отходов промышленности и сельского хозяйства. Эти ферменты осуществляют конверсию растительной биомассы и получение сахаров, биоэтанола в промышленности.

 

Выражение благодарности

Авторы выражают благодарность профессору Сагдиевой М.Г. (Институт микробиологии АН РУз) за ценные советы в ходе выполнения работы и обсуждения результатов.

 

REFERENCES

 

  1. Rabinovich M.L., Chernoglazov V.M., Klesov A.A. Klassifikasiya cellulas, ih rasprostranennost, mnojestvennie formi i mehanismi deystviya cellulas [Classification of cellulase and their spreading multiple forms and mechanisms of the action cellulose]. Itogi nauki i techniki. VINITI, ser. Biotehnologiya - Totals of the science and technology, series of biotechnology. Moscow, Publ. Nauka, 1998, vol. 11, pp. 4-149.
  2. Moloney A.P., S.I.McCrae, Wood T.M., and Coughlan M.P. Isolation and characterization of the 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolases of Talaromyces emersonii. J. Biochem., 1985, vol. 225, pp. 365-374.
  3. Kanda T., Wakabayashi K., Nishizawa K. Synergistic action of two different types of endo-cellulase components from Irpex lacteus (Polyporus tulipiferae) in the hydrolysis of some insoluble celluloses. J. Biochem., 1976, vol. 79, pp. 997-1006.
  4. Rodionova N.A. Fermentativnoyie rasshepleniyie cellulozi. Cellulazi mikroorganizmov. [Enzymatic saccharification of cellulose. Cellulase of microorganisms]. Kretovich V.L. ed. Moscow, Publ. Nauka, 1981, pp. 4-40.
  5. Rabinovich M.L., Nguen Van veet, Klesov A.A. Sinergizm pri sovmestnom deystvie endoglukanaz s visokim i nizkim srodstvom k sellulose [Synergism under joint action endogluconase with high and low relationship to cellulose]. Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya – Applied Microbiology and Biochemistry, 1986, vol. 22, no. 1, pp. 70-79.
  6. Mandels M., Reese E.T. Induction of cellulase in Trichoderma viride as influenced by carbon sources and metals. J. Bacteriol., 1957, vol. 73, pp. 269-278.
  7. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, vol. 72, pp. 248-254.
  8. Somogyi M. Notes on sugar determination. J. Biol. Chem., 1952, vol. 195, pp. 19-23.
  9. Laemli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, no. 5257 (227), pp. 680-685.
  10. Ulker A., Sprey В. Characterization of an unglycosylated low molecular weight 1,4-beta-glucan-glucanohydrolase of Trichoderma reesei. FEMS Microbiol. Lett., 1990, vol. 57, no. 3, pp. 215-219.
  11. Hall J., Hazlewood G.P., Barker P.J., Gilbert H.J. Conserved reiterated domains in Clostridium thermocellum endoglucanases are not essential for catalytic activity. Gene, 1988, vol. 15, no. 69(1), pp. 29-38.
  12. Langsford M.L., Gilkes N.R., Singh B., Moser B., Miller R.C. Jr., Warren R.A.J., Kilburn D.G. Glycosylation of bacterial cellulases prevents proteolytic cleavage between functional domains. FEBS Lett., 1987, vol. 225, pp. 163-167.
  13. Wood T.M., McCrae S.I., Macfarlane C.C. The isolation, purification and properties of the cellobiohydrolase component of Penicillium funiculosum cellulose. J. Biochem., 1980, vol. 189, pp. 51-65.
  14. Labudova I., Farkas V. Endoglucanases by Trichoderma reesei QM9414. Biochem. Biophys. Acta., 1983, vol. 744, pp. 135-140.
  15. Calza R.E., Irwin D.C. and Wilson D.B. Purification and characterization of two β-1-4-endoglucanases from Thermomonospora fusca. J. Biochemistry, 1985, vol. 24, pp. 7797-7804.
  16. Kim C-H. Characterization and substrate specificity of an endo-β-1,4-D-glucanse I (Avicelase I) from an extracellular multienzyme complex of Bacillus circulans. Appl. Environ. Microbiol., 1995, vol. 61, pp. 959-965.
  17. Stewart J.C., Heptinstall J. Cellulase of Aspergillus niger. Methods Enzymol., 1988, vol. 160, pp. 264-274.
  18.  Wood T.M., Mc.Crae S.I. The cellulase of T. koningii. Purification and properties of some endoglucanase components with special reference to their action on cellulose when acting alone and in synergism with the cellobiohydrolase. J. Biochem., 1978, vol. 171, pp. 61-72.
  19. Rumyanseva G.N., Rodionova N.A. Cellulasi mikroorganizmov, razdel “Ochistka i harakteristika dvuh tipov β–glukozidaz; sellobiazi i arilglukozidazi” [Cellulase of microorganism, section “Purification and feature two types β-glucosidases, cellobiase and arilglucosidases”]. Moscow, Publ. Nauka, 1981, 344 p.
  20. De Gussem R.L., Aerts G.M., Claeyssens M., De Bruyne C.K. Purification and properties of an induced beta-D-glucosidase from stachybotrys atra. Biochim. Biophys. Acta, 1978, vol. 525, pp. 142-153.
  21. Jeng W.Y., Wang N.C., Lin M.H., Lin C.T. et al. Structural and functional analysis of three β-glucosidases from bacterium Clostridium cellulovorans, fungus Trichoderma reesei and termite Neotermes koshunensis. J. Struc. Biol., 2010, vol. 173(1), pp. 46-56.
  22. Korotkova O.G. Polucheniye cellulasnikh kompleksov s uvelichennoy osaharivayushey sposobnostyu na osnove rekombinantnih shtammov Penicillium verruculosum. Diss. Kand. Khim. Nauk [The Reception cellulose complex with increased saccharification ability on base recombinant strains of Penicillium verruculosum. Kand. Khim. Sci. Diss.]. Moscow, Publ. MGU, 2011, 17 p.

 

TRICHODERMA HARZIANUM В1 САҢЫРАУҚҰЛАҚТАН ЦЕЛЛЮЛОЛИТТІК ФЕРМЕНТТЕР БӨЛІП  ШЫҒАРУ

 

Умаров Б.Р.1, Сағдиев Н.Ж.2, Ким А.Л.2, Инагамов У.К.2
1Өзбекстан Ғылым академиясының микробиология институты
А.
Қадыри. к-сі, 7б, Ташкент, 100128, Өзбекстан
2
Өзбекстан Ғылым академиясының А.С. Садыков атындағы биоорганикалық химия институты
Мирзо
Ұлықбек к-сі, 83, Ташкент, 100125, Өзбекстан
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

TYЙIH

2%-дық бидай кебегі бар ортада көміртектің бірден-бір көзі ретінде кеңінен өсіру жағдайында әткеншекте 200 айн./мин., 30±1оС температура кезінде  жергілікті штамм Trichoderma harzianum В1                5 тәулік ішінде целлюлолиттік ферменттер түзіп шығарды. Өсірінді сұйықтығында жасушадан тыс нәруыздар және целлюлаздық кешеннің ферменттері зерттелді. Алуан түрлі жүйелер хроматографиясының және G-75 сефадексіндегі түрлі гель-тасымалдаушылардың көмегімен Акрилекс П-60 пен ион айырбастаушы хроматография ДЭАЭ Тойперл 650М гелінде целлюлолиттік ферменттер бөлініп шығарылды және тазартылды.  Бөлініп шығарылған нәруыздар мен  ферменттердің молекулалық массасы белгілі молекулалық массаларға ие  маркерлік нәруыздарды пайдалана отырып,   0,1% SDS қатысуымен 12% ПААГ электрофорездің көмегімен  белгіленді. Үш изоформаның молекулалық массасы эндо-1,4-β-глюканазаның  (EC 3.2.1.4), EG 1, EG 2, және EG 3  ММ 35±1 кДа-ға сәйкес болды, целлюлолиттік белсенділігі 90,4, 77,52 және 78,92 бірл/мг нәруыз, және целлобиаздың төрт изоформасы (1,3-β-глюкозидазалар, EC 3.2.1.21), CBH 1, CBH 2, CBH 3 және CBH 4 - ММ 24±1 kDa-ға үйлесті, целлюлолиттік белсенділігі 2,60, 3,80, 4,3, және 3,0 бірл/мг нәруыз.  Зерттелетін ферменттердің целлюлолиттік белсенділігіне және тұрақтылығына температураның, рН ортаның металдар иондарының әсері зерттелді. Оптимальные температуры Эндо-1,4-β-глюканазаның және целлобиазаның (1,3-β-глюкозидазаның) оңтайлы температуралары были равны 50оС-ге тең және рН  4,8 шегінде болды.  Металдардың бір- және екі валентті иондарының K, Na, Fe, Mg және Mn әсері аралық ортада 1,4-β глюканаза ферменттерінің белсенділігін 10%-ға және 1,3-β глюкозида ферменттерінікін  15%-ға арттырды.

Негізгі сөздер: Trichoderma harzianum В1, изоформы эндо-1,4-β-глюканаза, 1,3-β-глюкозидаза изоформалары.