3/2014

 

633.527(043.3)

 

СИГНАЛЬНЫЕ ФУНКЦИИ ГОРМОНОВ И РЕАКЦИЯ ОТВЕТА НА СТРЕССОРЫ ПРИ ИНДУКЦИИ ПЫЛЬЦЕВОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА

 

С.С. Беккужина1, С.Н. Боровиков1, И.Рахимбаев2
1Казахский агротехнический университет им. С.Сейфуллина, пр. Женіс, 62, Астана, 010011, Казахстан
2
Институт биологии и биотехнологии растений, ул. Тимирязева, 42, Алматы, 050057, Казахстан
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it. , This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it. ,
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

АБСТРАКТ

В статье представлен обзор мировой литературы по теоретическим и прикладным аспектам гаплоидных технологий, в частности, рассматриваются пути повышения эффективности пыльцевого эмбриогенеза. В аналитическом обзоре детально обсуждаются вопросы по выявлению роли гормональных предобработок растений-доноров в индукции спорофитного пути развития микроспор. Баланс фитогормонов является одним из ключевых механизмов переключения микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития. Кроме того, детализируются вопросы влияния различных стрессоров на перепрограммирование микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития. При обсуждении данного вопроса все используемые предобработки растений, перед введением в культуру invitro, разделены на новые и старые приемы предварительной обработки.

Результатом наших экспериментальных исследований является создание эффективной биологической системы, позволяющей переключать развитие микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития на основе предобработки срезанных растений гормонами ауксинового типа действия – ИУК, 2,4-D с учетом содержания эндогенного ИУК в растениях. Разработанный способ повышает эффективность пыльцевого эмбриогенеза до 8%. Общепринятые методы предобработки заключаются в том, что гормональный фактор добавляется в индукционную среду, а в наших экспериментах предварительной обработке подвергались срезанные растения.

Ключевые слова: эмбриогенез, андрогенез, гаплоид, дигаплоиды, пыльца, регуляторы роста, стресс, микроспоры, спорофит, гаметофит, селекция.

 

SIGNAL FUNCTIONS OF HORMONES AND RESPONSE TO POLLEN EMBRYOGENESIS INDUCTION STRESSORS

 

S.S. Bekkuzhina, S.N.Borovikov, I. Rahimbaev
1S. Seifullin Kazah Agro Technical University,62Victory Square, Astana, 010011, Kazakhstan
2
Institute of Plant Biology and Biotechnology, 42 Timiryazevst., Аlmaty, 050040, Kazakhstan
sara-bek@yandex.
ru, This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it. This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ABSTRACT

The Article presents the world publications review on theoretical and applied aspects of haploid technologies, in particular the ways to increase pollen embryogenesis efficiency. The analytical review discusses in details the issues of donor plants hormonal pretreatment role in induction of microspore sporophytic development pattern.

Phytohormone balance is one of the key mechanisms of microspores shifting from gametophytic to sporophytic development pattern. In addition, the Article specifies the impact of various stressors on microspore reprogramming from gametophytic to sporophytic development pattern. In discussing this issue all plant pretreatments being in use are distributed into new and old pretreatment methods before in vitro introduction.The result of our experimental research is to create an effective biological system , that allows switching development of microspores from the gametophytic type to the sporophytic development type based on pretreatment of cut plants hormone of auxin cut type as - IAA, and 2,4-D with contents of endogenous IAA in plants. The developed method improves the efficiency of pollen embryogenesis to 8%. Conventional methods of pretreatment are that hormonal induction factor is added to the environment, and plants cut were subjected while pre-treatment in our experiments.

Кeywords: embryogenesis, androgynies, haploid,dihaploids pollen, gormon regulation, stress, microspores, sporophyt, gametophyte, selection.


ВВЕДЕНИЕ

Для ускорения селекционного процесса получение гомозиготных форм с помощью гаплоидных технологий является более эффективным. Особенно ценным для селекционеров и генетиков является ускоренное создание DH-линий методами биотехнологии, а также возможность индуцирования ценных мутаций [1].

Обзор мировой литературы показывает перспективность практического использования дигаплоидных форм в селекционных программах. Например, опыт внедрения гаплоидных технологий в сочетании с методами классической селекции позволило отобрать формы, сорта и гибридные особи с ценными хозяйственными признакам[1, 2, 3].

В обзоре BrianP. Forsterc соавторами детально обсуждаются теоретические, прикладные аспекты гаплоидных технологий, подробно описываются методы индукции гаплоидов и возможности использования удвоенныхгаплоидов в программах классической селекции. Кроме того, авторы акцентируют внимание на вопросах, изученных с помощью экспериментальнойгаплоидии в период длительного времени, которые ограничивали широкое применение удвоенных гаплоидных линий (DH-линий –double haploid)в селекции. Например, возвратное скрещивание –хорошо зарекомендовавший классический метод селекции, но требуется длительное время для того, чтобы элитная линия обладала ценными признаками. Использование маркерной селекции с удвоенными гаплоидными линиями повысило бы эффективность традиционной селекции.В вышеприведенной работе также обсуждается преимущество микроспор, как лучшей экспериментальной системы для изучения эмбриогенеза, а также для выявления эффекта стресса. Микроспоры табака развиваются invivo в зрелой двуклеточной пыльце (посередине). Изолированные микроспоры могут быть культивированы invitro до созревания, до формирования фертильной пыльцы на богатой среде с высокой концентрацией сахарозы (справа). Микроспоры, подверженные истощению при высокой температуре, формируют зародышевые клетки,которые развиваются в гаплоидные структуры при культивировании на богатой сахарозой среде при нормальной температуре, как показано слева на рисунке 1 [1].

Культура микроспор в получении удвоенных гаплоидов используется сегодня не только для табака, но и для рапса, перца, пшеницы, ячменя и риса.

В недалеком будущем успешное сочетание гаплоидов с обратимой мужской стерильностью может привести к значительному эффекту в улучшении растений. Это является инновационной технологией для селекции, так как имеются первые экспериментальные разработки на модельном объекте табаке [4,5].

Теоретические аспекты индукции гаплоидов детально обсуждались в ранних работах [6, 7, 8]. В настоящее время опубликованы работы, детализирующие стадии эмбриогенеза растений, в частности, о роли суспензора [9], эмбриогенез микроспор и новые взгляды на механизмы андрогенеза [10].

Figure-1.Use of various spontaneous and induced in vitromethods for DH production(Forster B.P., 2007)
 
Рисунок-1.Использование различных спонтанных методов и методов invitroдля получения DH-линий(ForsterB.P., 2007)
Figure-1.Use of various spontaneous and induced in vitromethods for DH production(Forster B.P., 2007)

 

Сложность механизмов спорофитного пути развития микроспор и регуляция спорогенных клеток в условиях invitro является важнейшей проблемой гаплоидных технологий. В компетенции микроспор, наряду с другими, можно выделить два основных фактора, определяющих переключение программы развития клетки с гаметофитного на спорофитный путь развития: 1) генотип растения-донора; 2) баланс эндогенных и экзогенных фитогормонов.

С помощью фитогормонов осуществляется взаимодействие клеток, тканей и органов. Гормоны необходимы для запуска и реализации физиологических программ, и, в целом, процессы роста и развития растений регулируются фитогормонами. Также как invivo, в условиях invitro процессы жизнедеятельности изолированной клетки регулируют ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины. В исследованиях по гормональной регуляции важным является выяснение следующих вопросов: сигнальные функции фитогормонов в осуществлении дистантных взаимодействий между клетками или органами растения; участие фитогормонов в ответных реакциях растений на стрессовые воздействия. Изучение механизмов действия фитогормонов привело к формированию концепции о сети гормональных сигналов растений, которая позволяет компетентной клетке «выбирать» из нескольких возможных направлений конкретный путь развития и обеспечивает взаимодействие регуляторных систем различных фитогормонов [11]. Очевидно, что изучение особенностей гормональной регуляции при стрессовом воздействии, а также в процессе перепрограммирования развития клетки при индукции пыльцевого эмбриогенеза в момент инокуляции пыльника, представляет особый интерес.

Методы определения фитогормонов трудоемкие и дорогостоящие, а самое главное, по мнению Р.Г. Бутенко, сложность изучения гормональной регуляции связана с интегральным характером морфогенетических процессов и их зависимостью от многих внешних и внутренних факторов [12].

 

ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС И ИНДУКЦИЯ ПЫЛЬЦЕВОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА

Прошло 50 лет с того времени как Guhaи Maheshwari впервые описали явление андрогенеза invitro и сообщили об успешном получении эмбриоидов пыльцевого происхождения у Datura. В настоящее время накоплен богатый экспериментальный материал по изучению данного явления. Несмотря на это, изучение роли гормонального баланса в реализации этого уникального явления у покрытосеменных растений носит разрозненный характер.

Известно, что переключение программы с нормального гаметофитного на спорофитный путь развития микроспор находится в прямой зависимости от уровня эндогенных и экзогенных фитогормонов. К сожалению, эту зависимость трудно четко определить, так как данный фактор прямо коррелирует с генотипом растений. Манипуляция концентрацией гормонов является генотип-зависимым показателем, отработанные для одного генотипа культуральные условия могут быть не оптимальными для иных гибридов, сортов и линий.Фитогормоны можно использовать как стресс для переключения программы с гаметофитного на спорофитный путь развития микроспор (рис. 2).

Изучению гормонального баланса в культуре пыльников пшеницы в связи с проблемой пыльцевого эмбриогенеза invitro посвящено ряд монографий и статей [13,14].

Figure-2.Сhematic presentation of the gametophytic and sporophyticpathways in microspores (Mehran, 2006)
 
Рисунок-2.Cхематическое изображениегаметофитного и спорофитного пути развития микроспор (Mehran,2006)
Figure-2.
Сhematic presentation of the gametophytic and sporophyticpathways in microspores (Mehran, 2006)

 

Выявлено [15], что при внесении в питательную среду низких концентраций 2,4-D способность к андрогенезу повышается у сортов, содержащих высокий уровень ИУК, а для сортов с низким содержанием эндогенной ИУК необходимо внесение в питательную среду повышенных концентраций 2,4-D. Не вызывает сомнения положение о том, что для увеличения частоты пыльцевого эмбриогенеза необходимо создавать определенный гормональный баланс. Экзогенные фитогормоны необходимо добавлять с учетом в изолированных тканях нативных гормонов в момент инокуляции пыльника.

Однако возникает вопрос: можно ли эти условия оптимизировать? Определить гормональный статус каждого генотипа очень сложно. На наш взгляд, особо важным является решение задачи по разработке «генотип-независимых» приемов, так как константные формы необходимо получать для всех перспективных генотипов и гибридов, представляющих интерес для генетиков и селекционеров.

Накоплен определенный эмпирический материал по действию экзогенного ауксина, в частности, 2,4-D, и подробно изучена ответная реакция различных генотипов на его присутствие в питательной среде. При культивировании пыльников на искусственных питательных средах без добавления ауксина у большинства видов растений андрогенез invitro не индуцируется, в том числе для всех изученных генотипов пшеницы [16, 17]. Например, для некоторых растений только при совместном присутствии 2,4-D с гибберелловой кислотой в питательной среде [18] или ГК с бензидазолом получены положительные результаты.

В связи с тем, что ауксины оказывают влияние на клеточную дифференцировку, присутствие этого гормона в питательной среде является необходимым условием индукции морфогенеза. Это необходимо учитывать и при индукции пыльцевого эмбриогенеза. Кроме того, гормональный состав питательной среды является специфичным фактором, в индукции путей морфогенеза, который изучается для различных представителей видов. Например, пшеницы [19]и некоторых других растений. 

В экспериментальных исследованиях при обработке срезанных растений гормонами ауксинового типа действия (2,4-D) было выявлено, что повышение концентрации гормона увеличивает частоту выхода эмбриоидов у всех изучаемых генотипов (рис. 3). Например, частота образования эмбриоидов у линии Ю580R в контроле составила 0,6%, а при обработке 0,04%-ным раствором 2,4-D этот показатель повысился до 3%, но для данной линии увеличение концентрации угнетает пыльцевой эмбриогенез. Для сорта Целинная-Юбилейная при обработке срезанных колосьев 2,4-D в концентрации 0,03% выход эмбриоидов составил 8%. 

Figure-3.Induction of a pollen embryogenesis in the process of the cutting-off plants 2,4-D. a – Kazakhstan early ripe; b– Ю580; c – Tselinnaya-Yubileynaya
 
Рисунок-3. Индукция пыльцевого эмбриогенеза при обработке срезанных растений 2,4-D. а – Казахстанская раннеспелая; б – Ю580;c – Целинная-Юбилейная.
Figure-3.Induction of a pollen embryogenesis in the process of the cutting-off plants 2,4-D. a – Kazakhstan early ripe; b– Ю580; c – Tselinnaya-Yubileynaya

 

Для познания закономерностей гормональной регуляции процессов клеточной дифференцировки и морфогенеза invitro необходимо углубленное изучение молекулярных механизмов действия фитогормонов. 

Показано, что ауксин экспрессирует гены, участвующие на конечных этапах реализации ауксинового сигнала. Установлен регуляторный элемент промотора генов, экспрессия которых регулируется ауксином. В настоящее время в геноме арабидопсиса обнаружено семейство генов, состоящее из 24 генов, индуцируемых ИУК — Аих/IAA[20]. Для лучшего понимания разных ответов одного и того же гормона можно привести уникальную схему действия ауксинов в регуляции генома растений,как показанорисунке 4[11].

Можно предположить, что ауксины регулируют сигнальную систему генов, ответственных также и за переключение программы развития микроспор с гаметофитного пути на спорофитныйпуть в процессе андрогенеза invitro.

Выявлено, что у Hordeum vulgare L. добавление AБК в культуру пыльников увеличивает жизнеспособность и понижает возникновение апоптозной способности микроспор. АБК действует как ингибитор синтеза мРНК и, вполне возможно, препятствует синтезу определенных РНК, небходимых для гаметофитного развития с помощью блокирования гаметофитного пути, и таким образом переключая на спорофитное развитие [21].

Figure-4. The scheme of regulation of an expression of genes auxin with participation of transfactors
 
Рисунок-4.Схемарегуляции экспрессии генов ауксином с участием трансфакторов ARF и Aux/IAA (Кулаева О.Н., Кузнецов В.В., 2004)
Figure-4. The scheme of regulation of an expression of genes auxin with participation of transfactors

 

Обсуждая роль фитогормонов в процессе эмбриогенеза invitro, исследователи чаще всего говорят о содержании гормонов в индукционной среде. Для выяснения компетенции микроспор при пыльцевом эмбриогенезе необходимо детально изучить и выявить гормональный статус растений-доноров. Мы решили подойти к этой проблеме с другой стороны – определить уровень эндогенных фитогормонов и далее определять, когда, как и каким образом обрабатывать фитогормонами растения-доноры, не меняя концентрацию гормонов в индукционной среде. Исследователи давно пришли к мнению о необходимости учета уровня эндогенных фитогормонов в экспланте при культивировании, но всё остается на уровне констатации фактов.

Нами установлено, что обработка срезанных растений гормонами в некоторых вариантах увеличивает частоту выхода эмбриоидов в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия. Однако этот эффект зависит от типа применяемых гормонов.

При индукции пыльцевого эмбриогенеза одним из пусковых сигналовспорофитного пути развития микроспор является определенное содержание эндогенной и экзогенной индолилуксусной кислоты (ИУК). Ответная реакция культуры пыльников при введении ИУК зависит от эндогенного содержания ИУК в момент инокуляции пыльника. Например, в работе Горбуновой показано [16], что экспланты с высоким содержанием эндогенных ИУК и АБК способны регулировать морфогенетические процессы в культуре пыльников пшеницы при отсутствии экзогенных гормонов. У сортов с низким содержанием ИУК без добавления экзогенного ауксина микроспоры не могут переключиться на спорофитный путь развития, причем необходимы высокие концентрации 2,4-D.

Наши результаты согласуются с литературными данными. Однако в работе нами модифицирован регламент предобработки растений: срезанные растения обрабатывают ИУК в концентрации 0,005-0,1% в течение 7-10 суток с последующим культивированием пыльников на среде, не содержащей ИУК. Эндогенный гормональный баланс фитогормонов определяли для линий, индуцированных в культуре invitro. Результаты исследований, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что у линии ЛГВ2-92-2 содержание ИУК составляет 37,00 нг/г сухого веса, что выше по сравнению с другими линиями.

 

Таблица1.Эндогенное содержание фитогормонов в надземной части растений яровой пшеницы в фазе кущения

Table 1.The endogenous maintenance of phytohormones in elevated part of plants of a spring-sown field in a kushcheniye phase

Варианты опыта

Experienceoptions

ИУК,

нг/г сухого веса

IAA, ng/gdryweight

ЦТК,

мкг/г сухого веса

µg/gdryweight

ГК,

нг/г сухого веса

GA, ng/gdryweight

АБК

нг/г сухого веса

ABA, ng/gdryweight

Ю 580R

18,50 ±1,2

2,26±0,40

44,98±2,8

290,9±2,8

ЛГВ2-92-2

37±3,1

1,17±0,2

598,58±1,3

145,5±1,2

ЛГВ3-692-3-5

18,5±1,5

3,35±1,1

364,68±3,9

872,7±1,9

ЛГВ1-92-2

17,50±2,3

1,94±0,2

69,2±2,3

436,4±2,6

После определения эндогенного содержания фитогормонов установлено, что индукция андрогенеза invitro находится в прямой зависимости от уровня эндогенных гормонов. Обработка ИУК повышает частоту образования эмбриоидов у линии ЛГВ2-92-2. У данной линии эмбриогенная способность в контрольном варианте составляет 5,1%, а при обработке растений 0,04%-ным раствором ИУК значительно повышается до 8%. Следовательно, можно предположить, что для индукции пыльцевого эмбриогенеза необходимо высокое содержание эндогенной индолилуксусной кислоты в момент инокуляции пыльника, и при этом дифференцированно подбирать концентрацию экзогенной ИУК.

Для тех генотипов, в которых содержится мало ИУК, необходимо использовать более высокие концентрации для обработки растений. Например, для линий ЛГВ3-692-3-5, ЛГВ1-92-2, где приблизительно одинаковое содержание ИУК, повышение концентрации экзогенного ауксинадо 0,1% увеличивает частоту выхода эмбриоидов по сравнению с контролем[22].Результаты наших экспериментальных исследований по обработке срезанных колосьев абсцизовой кислотой показали, что повышение концентрации АБК до 0,04% снижает эффективность эмбриогенеза для всех испытуемых генотипов.

 

Влияние физических и химических агентов на пыльцевой эмбриогенез

В настоящее время все больше расширяются виды предварительных обработок растений, используемых в качестве стрессора для перепрограммирования микроспор с нормального гаметофитного на сопрофитный путь развития.  

Figure-5.Of widely used, neglected and novel stresses
 
Рисунок-5. Cтрессоры, широко применяемые, неактуальные и новые(Mehran, 2006).
Figure-5.Of widely used, neglected and novel stresses

 

Кроме широко известных видов обработки, описываются и эффективно влияющие на частоту образования гаплоидных структур, так называемые новые виды стрессоров. Группы стрессоров, применяемые для компетенции микроспор, показаны на рисунке 5.

Предобработка пониженными температурами. Известно, что предобработка низкими температурами колосьев злаковых[23,24]и цветочных бутонов цитрусовых [25]повышает эффективность пыльцевого эмбриогенеза.Существует множество сообщений, в которых обсуждаются вопросы предобработки растений. Например, почему предобработка низкими температурами способствует повышенному выходу гаплоидных зародышей: понижает процесс деградации в тканях пыльника, защищая микроспоры от токсичных соединений, ведущих к распаду пыльников [26]; облегчает выживание большего количества эмбриогенных пыльцевых зерен [27]; увеличивает частоту эндоредупликации и приводит к увеличению спонтанных дигаплоидных растений [28]. Утвердилось мнение о том, что микроспоры, в обработанных холодом пыльниках, отделяются от тапетума, приводящего в свою очередь к углеродному голоданию, как один из индукторов эмбриогенеза пшеницы [29], риса [30]. Возможно, что при холодовой предобработке микроспоры адаптируются к измененным условиям метаболизма и тем самым индуцирует пыльцевой эмбриогенез.

При изучении индукции пыльцевого эмбриогенеза на уровне генов выявлено,что во время холодовой обработки экспрессируют два маленьких гена белков теплового шока (HSP гены) [31]. У твердой пшеницы холодовая предобработка увеличивает выход зеленых регенерантов, как предполагают Labbani с соавторами, возможно, при этом ингибируются механизмы старения [23].

Детальный мониторинг ранних и более поздних публикаций исследователей о влиянии стрессоров на частоту выхода пыльцевого эмбриогенеза, а также о механизмах репрограммирования микроспор приводится в новых обзорах[32, 33].

В мировой практике большое внимание уделяют предобработке эксплантов различными химическими и физическими агентами, которые в зависимости от концентрации и временной экспозиции могут влиять положительно на индукцию эмбриогенеза в условиях in vitro. Например, обработка изолированных микроспор колхицином является эффективнымдля B. napus [34]. Колхицин можно использовать как деполимеризирующий агент микротрубочек, ведущий к изменениям во время деления клеток [35]. Данные об эффективности влияния на преключение программы развития микроспор отмечены для рапса [36] и кукурузы [37]. У пшеницы обработка изолированных микроспор колхицином (до 3 мМ в течение 24-48 ч) увеличивала процентный выход фертильных регенерантов с 15% (в контроле) до 53% [38].

γ-облучение. Увеличение индукции эмбриогенеза в культуре пыльников при использовании γ-облучения омечено для Nicotiana,Datura иWheat[39,40]. Однако противоречивые результаты получены на других культурах.

Гипертонический шок. Предобработка пыльников пшеницы сахарозой в концентрации 0,8 М приводила к увеличению частоты индукции эмбриогенеза [41]. Некоторые положительные результаты получены и при совместной обработке пыльников 0,8 М сахарозой с 3% активированным углем. Начало спорофитного деления было отмечено при предварительном культивировании микроспор перца в течение 4 часов на среде с обогащенной сахарозой, и затем культивирование на среде без нее [42].

Пониженное атмосферное давление. Существует мнение о повышении эффективности пыльцевого эмбриогенеза при использовании в качестве предобработки пониженного атмосферного давления. Возможно, что низкий уровень атмосферного O2 или быстрое истощение газов в период культивирования пыльников стимулирует эмбриогенез. Положительное влияние пониженного атмосферного давления показано на табаке [21].

Факторы феминизации пола. В литературе имеются данные об использовании веществ,сдвигающих пол растения в сторону феминизации. Например, предобработки растений-доноров табака путем распыления и орошение почвы нафтилуксусной кислотой и Alar 85 увеличивали частоту пыльцевого эмбриогенеза [43]. В то время как для перца (CapsicumannuumL) применение гибберелловой кислоты и этрела, как факторов детерминации пола, было не эффективным[44].

В наших экспериментальных исследованиях, при использовании аконитовой и феруловой кислоты в качестве феминизирующего фактора,выявлено, что феруловая кислота не влияет на частоту эмбриогенеза. По результатам наших исследований, использование в культуре пыльников пшеницы других агентов половой детерминации также не дали положительных результатов, например, хлорэтиловая кислота, гибберелловая кислота (ГК). Наши результаты согласуются с данными литературных источников. Предобработка срезанных растений аконитовой кислотой не оказала существенного влияния на частоту эмбриогенеза. Однакоэмбриоиды, полученные на варианте, проявили высокий морфогенетический потенциал, в результате чего в 100% случаев из них формировались растения-регенеранты, что не было отмечено в других вариантах[45].

Среда с высоким уровнем pH. В последнее время появились работы, в которых обсуждаются преимущества использования в культуре пыльников и микроспор различных уровней pH среды для индукции эмбриогенеза. Например, у табака формирование эмбриоидов наблюдали при pH 5,0. При высоком уровне рН установлено, что активность инвертазы сильно понижается, приводя к понижению расщепления сахарозы [46] Таким образом, истощение, т.е. углеродное голодание приводит к репрограммированию и, следовательно, к переключению микроспор на спорофитный путь развития.

Стресс на тяжелые металлы. Тяжелые металлы, такие как CdCl в концентрации 0,6 M, успешно используется в качестве стрессовой обработки для индукции эмбриогенеза микроспор [47].

Обработка различными кислотами. Например, 2-гидрооксиникотиновая кислота (2-ГНК), бензотриазол (БТ), БТ-5-карбоксиловая кислота (Б-5-КК), 2,3-пиридин карбоксиловая кислота (2,3-ПКК), в частности, 2-ГНК, Б-5-КК оказались высокоэффективными[48]. Положительный эффект совместного использования предобработки льна 1-нафтилуксусной кислотой и паклобутразола (0,1 мг/л нафтилуксусная кислота+10 мг паклобутразола) показан [49]. Возможно, что химические вещества не только запускают процесс эмбриогенеза, но и воздействуют на дальнейшую регенерацию зеленых растений в культуре пыльников и микроспор.

Таблица 2.Влияниенезначимых и новых стрессов на пыльцевой эмбриогенез для разных видов растений (Mehran, 2006)

Table 2.Influence of insignificant and new stresses on a pollen embryogenesis for different types of plants

Виды растений

Planttypes

Стресс

Stress

Стадия развития пыльника

Microsporestage

Результаты

Result

Способы

System

Табак

Tobacco

рН

Поздняя одноклеточная

Эмбриоид, регенерант

Культура пыльников

Табак

Tobacco

 

рН

Поздняя одноклеточная, премейотическая

Многоклеточные образования

Культура пыльников

Брокколи

Broccoli

Каррагенан олигосахариды+ повышенная t

Поздняя одноклеточная, ранняя двухклеточная

Симметрич

ное деление

Культура пыльников

Табак

Tobacco

АБК

Ранняя двухклеточная

Эмбриоид, регенерант

Культура пыльников

Табак

Tobacco

Низкое атмосферное давление

Ранняя двухклеточная

Эмбриоид, регенерант

Культура пыльников

Пшеница

Wheat

Гипертоничес

кий шок

Средняя и поздняя одноклеточная

Каллус, регенерант

Культура пыльников

Табак

Tobacco

Цетрифугирова

ние

Поздняя одноклеточная

Эмбриоид, регенерант

Культура пыльников

Пшеница

Wheat

Индуктор-химикаты

Средняя и поздняя одноклеточная

Эмбриоид, регенерант

Культура пыльников

Пшеница

Wheat

Индуктор-химикаты/

повышенная температура

Средняя и поздняя одноклеточная

Эмбриоид, регенерант

Культура пыльников

Кукуруза

Maize

Индуктор-химикаты/

холод

Поздняя одноклеточная, ранняя двухклеточная

Эмбриоид/

каллус, регенерант

Культура пыльников

 

В обзоре MehranE. с соавторами приведены все виды предварительной обработки растений и их результаты. В работе показана их эффективность на выход пыльцевых эмбриоидов, принадлежащих к различным видам растений, которые использовались в ранних работах, а также обсуждаются новые виды стрессоров для индукции пыльцевого эмбриогенеза (таблица 2). В данной таблице приводятся и авторы, которые получили результаты по обработке пыльников на разных стадиях развития [50].

В книге RobertaH.Smith(2013), которая является итогом многолетних работ по культуре тканей, в частности, в 9 главе обсуждаются вопросы предобработки, которые прямо коррелируют с реакцией ответа генотипа при культивировании пыльников и микроспор (51).

Одни стрессы используются в широком диапазоне разновидностей, тогда как другие применимы только в ограниченном числе. Например, показано, что такие факторы как высокая температура и голодание самостоятельно или в комбинации друг с другом эффективны для табака (Solanaceae), пшеницы (Poaceae) и B. napus (Brassicaceae).Однако, томаты, которые находятся в том же семействе, что и табак, эти стрессовые условия не приводят к положительным результатам.

Выбор физических и химических агентов, влияющих на пыльцевой эмбриогенез, зависит от вида растений, от концентраций, времени и способов обработки. Важным моментом стрессового воздействия является то, что одни стрессоры влияют на индукцию эмбриогенеза, другие на выход растений–регенерантов. Ни один из вышеназванных агентов не является универсальным индуктором спорофитного развития микроспор. Кроме того, для разных видов одни и те же индукторы способствуют как симметричному, так и асимметричному делению микроспор.

Таким образом, до конца не выяснено, какой из перечисленных стрессоров является направляющим по переключению микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития. Кроме того, не выяснено, какие из них играют прямую, а какие косвенную роль в изменении механизмов развития репродуктивных клеток.

Итак, гаплоидные технологии являются перспективными в поиске путей по расширению генетического базиса растений на устойчивостьк биотическим и абиотическим стрессам. В генно-инженерных работах также применяют технологию быстрой гомозиготизации или индукции рецессивных мутации через культуру пыльников [52].Использованиеудвоенныхгаплоидных линииоблегчает картирование ценных агрономических признаков[53]. Следующей перспективной возможностью гаплоидных технологий являются определённые преимущества селекции мужского гаметофита, который может иметь позитивный эффект на появляющуюся в результате спорофитную генерацию.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время создана экспериментальная система поповышению эффективности пыльцевого эмбриогенеза и выявлена роль гормональных предобработок растений-доноров в индукции спорофитного пути развития микроспор растений. Определенный баланс фитогормоновспособствует повышению компетенции микроспор, который необходим для эффективного использования гаплоидных технологий.При переключенииразвития микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития важным является экзогенная предобработка срезанных растений гормонами ауксинового типа действия–ИУК, 2,4-D, но с учетом содержания эндогенного ИУК в растениях.Вариабельность концентраций гормонов является генотип-зависимым показателем, и оптимизированные для одного генотипа условия культивирования не могут подходить для других гибридов, сортов и линий. Кроме того, для переключения программы развития микрoспор с гаметофитного на спорофитный путь развитиямикроспор является важным фактором обработка химическими и физическими агентами, которая зависит от генетической конституции вида растений.

 

REFERENCES

  1. Forster B.P., Heberle-Bors E, Kasha K.J, Touraev A The resurgence of haploids in higher plants. Trends Plant Sci., 2007, Aug., no. 12(8), pp. 368-375.
    PubMed
  2. Xu L., Najeeb U.Haploid and Doubled Haploid Technology.Advances in Botanical Research,2007, vol. 45,pp.181-216.
  3. Germana M.A. Gametic embryogenesis and haploid technology as valuable support to plant breeding. Plant Cell Rep., 2011, vol.30, no.5, pp.839-57.
    PubMed
  4. Ribarits A. Combination of reversible male sterility and doubled haploid production by targeted inactivation of cytoplasmic glutamine synthetase in developing anthers and pollen.Plant Biotechnol. J., 2007, vol. 5, pp. 483-494.
  5. COST action 851 website.
  6. Konzak C.F., Zhou H. Anther culture methods for double haploid production in wheat. Cereal Res. Comm,1991, no. 19, pp. 147-164.
  7. Data S., Potrykus I. Embryogenesis and plant regeneration from microspores of both “Indica” and “Japonica” rice (Orisa s.).Plant Sciense, 1990, no. 67,  pp.83-88.
  8. Hu H. In vitro induced haploids in wheat. In: Jain S.M., Sopory S.K., Veilleux R.E. (eds) In vitro haploid production in higher plants, Kluwer, Dordrecht, 1997,pp.73-97.
  9. Supena J., Winarto B., Riksen T., Dubas E., A. van Lammeren, Offringa R., Boutilier K., Custers J. Regeneration of zygotic-like microspore-derived embryos suggests an important role for the suspensor in early embryo patterning. J. of Experimental Botany, 2008, no. 59(4), pp. 803.
    CrossRef
  10. Segui-Simaro J.M., Nuez F. How transform into haploid embryos: changes associated with embryogenesis induction and microspores-derived embryogenesis. Physiol Plant,2008,vol.134, no. 1, pp. 1-12.
    CrossRef
  11. Kulaeva O.N., Kusnetsov V.V. Analiticheskii obzor: novejshie dostizhenija i perspektivy izuchenija mehanizma dejstvija fitogormonov v signalnyh sistemah celogo rastenija [Analytical review: the latest achievements and prospects of studying the mechanism of plant hormones action and their participation in the signaling systems in the plant]. Vestnik RFFI- Bulletin of RFFI, 2004, no. 2, pp. 12-26.
  12. Butenko R.G. Indukcija morfogeneza v culture tkanej rastenij Gormonalnaja reguljacija ontogeneza rastenij. [Induction of morphogenesis in the plant tissue culture]. Hormonal regulation of plant ontogenesis, 1984, pp. 42-54.
  13. Batygina T.B., Kruglova N.N.Metodicheskie rekomendacii po issledovaniju morfogeneticheskogo potenciala pylnikajarovojmjagkojpshenicy[Methodological recommendations on research morphogenetic potential anther spring wheat].IB UNC RAN. Ufa, 2001, 39 р.
  14. Gorbunova V.IU.,Krugulova N.N., Abramov S.N. Indukzijaandrogeneza in vitro u ijaravoimijagkoipshenizy; balansendogennyhiekzogennyhfitogormonov[Induction ofin vitro androgenesisofspring wheat: the balance of endogenous and exogenousphytohormones]. Izv. RAN, ser. biol. I. RAN Ser. Biol., 2001, no. 1, pp. 31-36.
  15. Gorbunova V.IU. Androgenezin vitro u ijaravoimijagkoipshenizy;Diss.dokt. biol. nauk[In vitro androgenesisofspring wheat. Dr. biol.sci. diss.].Мoscow, 2000, 378 p.
  16. Chen Y., Dribnenki P.Effect of genotype and medium composition on flax linumusitatissimum L. anther culture.Plant Cell Rep., 2002, vol. 21, pp. 204-207.
    CrossRef
  17. AssaniА.,Bakry F., Kerbellec F., Haicour R. et al. Production of haploids from anther culture of banana [Musa balbisiana {BB}].Plant Cell Rep., 2003, no. 21, pp. 511-516.
  18. Moieni A., Sarrafi A. The effects of gibberllic acid phenyletthula mine, 2,4-D and genotypes with on androgenesis in hexaploid wheat (Trticumaestivum) Cereal res. Common., 1996, vol. 24, no. 2, pp.139-145.
  19. Konieczny R., Czaplicki A.Z., Golczyk H., Przywara L.Two pathways of plant regeneration in wheat anther culture.Plant Cell Tissue Organ Cult, 2003, no. 73, pp. 177-187.
    CrossRef
  20. Leyser O. Molecular Genetic of Auxin SignalingAnnu. Rev. Plant Biol, 2002, vol. 53, pp. 377-398.
    PubMed
  21. Imamura J., Harada H. Stimulatory effect of reduced atmospheric pressure on pollen embryogenesis.Naturwissenschaften, 1980, no. 67, pp. 357358.
    CrossRef
  22. Bekkuzhina S.S., Kalashnikova E.A.Rol' IAA v prozesseandrogenezain vitro ijaravoimijagkoipshenizy[The role ofIAAin thein vitroandrogenesisof spring wheat].Nature and Engineering Sciences, 2010, no. 5, рp.158-162.
  23. LabbaniZ., Richard N., J. De Buyser, Picard E.Chlorophyllian durum wheat plants obtained by isolated microspores culture: importance of the pretreatment.CR Biol., 2005, no. 328, pp. 713-723.
    CrossRef
  24. Marciniak K., Kaczmarek T. Adamski, Surma M. The anther-culture response of triticale line tester progenies.Cell MolBiolLett, 2003,no. 8, pp. 343-351.
    PubMed
  25. Germanàa M.A., Chiancone B. Improvement in Citrus clementinaort.Ex Tan. microspore derived embryoids induction and regeneration. Plant Cell Rep, 2003, no. 22, pp. 181-187.
    PubMed
  26. Duncan E.J., Heberle E. Effect of temperature shock on nuclear phenomena in microspores of Nicotianatabacum and consequently on plant let production.Protoplasma, 1976, no. 90, pp. 173-177.
    CrossRef
  27. Sunderland N., Roberts M. Cold-pretreatment of excised flower buds in float culture of tobacco anthers.Ann Bot, 1979, no. 43, pp. 405–414.
  28. Amssa M., De Buyser J., Henry Y. Origin of diploid plants obtained by in vitro culture of anthers of young wheat (Triticumaestivum L.).Cr AcadSci D Nat., 1980, no. 290, pp. 1095-1097.
  29. Touraev A.A.,IlhamO., VicenteE.Heberle-BorsStress induced microspore embryogenesis from tobacco microspores: an optimized system for molecular studies.  Plant Cell Rep., 1996, no. 15, pp. 561-565.
    CrossRef
  30. Ogawa T., Fukuoka H., Ohkawa Y. Induction of cell division of isolated pollen grains by sugar starvation in rice.Breed Sci., 1994,no. 44, pp. 75-77.
  31. Sabehat A.,Lurie S., Weiss D. Expression of small heat-shock proteins at low temperatures: a possible role in protecting against chilling injuries. Plant Physiology, 1998, no. 117, pp. 651-658.
    CrossRef
  32. Islam S.M., Tuteja N. Enhancement of androgenesis by abiotic stress and other pretreatments in major crop species. Plant Sci., 2012, no. 182, pp. 134-144.
  33. Germanàa M.А., Benedetta C.,Padovana D., Bárány I. et. al. Firststages ofmicrospore reprogramming toembryogenesis through anther culture in Prunus armeniaca.L. Plant Sci,2012, no. 182, pp.134-44.
  34. Zhou W.J., Hagbery P., Tang G.X. Increasing embryogenesis and doubling efficiency by immediate colchicines treatment of isolated microspores in spring. Brassica napusEuphytica, 2002, no. 128, pp. 27-34.
    CrossRef
  35. Kasha K.J., Palmer C.E., Keller W.A., Kasha K.J. (eds) Chromosome doubling and recovery of doubled haploid plants.Biotechnology in Agriculture and Forestry, 2005,vol. 56. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, pp. 123-152.
    CrossRef
  36. Zhao J.P.,Simmonds D.H., Newcomb W. Induction of  embryogenesis with colchicines instead of heat in microspores of  Brassica napus L. cv.Topas.Topas Planta, 1996, no. 198, pp. 433-439.
    CrossRef
  37. Obert B.,Barnabas B. Colchicine induced embryogenesis in maize.Plant Cell Tiss Org Cult, 2004, no. 77, pp. 283-285.
  38. Hansen N.J.P., Andersen S.B. In vitro chromosome doubling with colchicines during microspore culture in wheat (Triticumaestivum L.). Euphytica, 1998, no. 102, pp. 101-108.
    CrossRef
  39. Shtereva L.A.,Zagorska N.A., Dimitrov B.D., Kruleva M.M., Oanh H.K. Induced androgenesis in tomato (Lycopersiconesculentum Mill). II. Factors affecting induction of androgenesis. Plant Cell Rep.,1998, no. 18, pp. 312-317.
    CrossRef
  40. Zhao L., Liu L.,Wang J., Guo H.et.al.Development of a new wheat germplasm with high antherculture ability by using a combination of gamma-ray irradiation and anther culture.J Sci Food Agric., 2014, Apr 11. doi: 10.1002/jsfa.6691. [Epub ahead of print].
  41. Wang J.J., Hu D.F., Wang H.M., Tang Y.L. Studies on increasing the induction frequency of pollen callus in wheat.Hereditas (Beiging), 1981, no. 13, pp. 28-29.
  42. Supena E.D.,Suharsono S., Jacobsen E., Custers J.B.M. Successful development of ashed-microspore culture protocol for doubled haploid production in Indonesian hot pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell Rep., 2005, pp. 35-42.
    CrossRef
  43. Heberle-Bors E. Induction of embryogenic pollen grains in situ and subsequentinvitropollensembryogenesisin Nicotianatabacum L.bytreatmentsofthepollendonorplantswithfeminizingagents.PhysiolPlant,1983, no. 59, pp. 67-72.
    CrossRef
  44. Bennett M.D., Hughes W.G. Additional mitosis in wheat pollen induced by ethrel.  Nature,1972, no. 240, pp. 566-568.
    CrossRef
  45. Bekkuzhina S.S. Gaploidnye tehnologii v uskorennom sozdanii ishodnyh form i linij jarovoj mjagkoj pshenicy, ustojchivyh k zasuhe i Septoria nodorum berk. Doct. Diss. Moscow, 2011, 134 p.
  46. Barinova J., Clement C., Martin L., Baillieul F., Soukupova H., Heberle-Bors E., Touraev A. Regulation of developmental pathways in cultured microspores of tobacco and snap dragon by medium pH.Planta,2004, no. 219, pp. 141-146.
    CrossRef
  47. Ikeda-Iwai M., Umehara M., Satoh S., Kamada H. Stress-induced somatic embryogenesis in vegetative tissues of Arabidopsis thaliana.The Plant J., 2003,no. 34, pp. 107-114.
    PubMed
  48. Zheng M.Y., Liu W., Weng Y., Polle E., Konzak C.F. Culture of freshly isolated wheat (Triticumaestivum L.) microspores treated with inducer chemicals. Plant Cell Rep, 2001, no. 20, pp. 685-690.
    CrossRef
  49. Polijakov A.V. Biotehnologija v selekziilna[Biotechnologyin breeding of flax]. Izdanievtoroe. Moscow, 2010, 202 p.
  50. Mehran E. Shariatpanahi, UgarBal, Ervin-Heberli-Bors and AlisherToraev. Stresses applied for the re-programing of plant microspores towards in vitro embryogenesis.  Physiology Plantarum,2006, pp. 1-16.
    CrossRef
  51. 51.RobertaH.HaploPlantsfrom Anther CulturePlant Tissue Culture: Third Edition. Techniques and SmithExperiment,2013.
    CrossRef
  52. Datta K., Sahoo G., Krishnan S., Ganguly M.DattaSKPLoS One. Genetic stability developed for β-carotene synthesis in BR29 rice line using dihaploidhomozygosity. PLoS One., 2014, no. 9(6).
    CrossRef
  53. Perera P.I., Ordoñez C.A., Dedicova B., Ortega PE. Reprogramming of cassava (Manihotesculenta) microspores towards sporophyticdevelopment AoB Plants., 2014, no. 6. pii: plu022.
    CrossRef

 

ТҮЙІН

Мақалада гаплоидтық технологиялардың теориялық және қолданбалы аспектілері бойынша әлемдік әдебиетке шолу берілді, атап айтқанда, тозаң эмбриогенезінің тиімділігін арттыру жолдары қарастырылады. Аналитикалық шолуда микроспоралар дамуының спорофиттік жолын индукциялауда донор-өсімдіктерді алдын алагормональдық өңдеудің рөлін анықтау жөніндегі мәселелер толық талқыланады.  Фитогормондардың тепе-теңдігі микроспораларды гаметофиттік даму жолынан спорофиттікке ауыстыруда негізгі тетіктердің бірі болып табылады. Бұдан басқа, микроспораларды гаметофиттік даму жолынанспорофиттік даму жолына қайта бағдарламалауға түрлі стрессорлар әсерінің мәселелері егжей-тегжейленеді. Бұл мәселені талқылау кезінде барлық пайдаланылатын алдын ала өңдеу өсімдіктері өсіріндіге in vitro енгізу алдында  алдын ала өңдеудің жаңа және ескі әдістеріне бөлінген.

Біздің тәжірибелік зерттеуіміздің нәтижесі, микроспоралардың дамуын гаметофитті жолдан спорофитті жолға ауыстыру негізінде, өсімдіктерде эндогенді ИСҚ -тің болуына байланысты кесілген өсімдіктерді ИСҚ және 2,4-D ауксин гормондарымен алдын ала өңдеу арқылы, тиімді биологиялық жүйе құру болып табылады. Әзірленген тәсілтозаң эмбриогенезінің тиімділігін 8%-ға дейін арттырады. Жалпыға бірдей алдын ала өңдеу әдістері гормондық факторды индукциялық ортаға қосуға негізделген, ал біздің тәжірибемізде алдын ала өңдеуге кесілген өсімдіктер қолданылды.

Кілтті сөздер: эмбриогенез, андрогенез, гаплоидтар, дигаплоидтер, тозаң, өсу реттеуіштері, стресс, микроспоралар, спорофит, гаметофит, сұрыптау.