2/2017
Zhagipar F.S., Nechay N.L., Moldagulova N.B., Yagofarova A.Ya., Berdimuratova K.T., Kakimzhanova A.A.
National center for biotechnology,
Korgalzhin hwy, 13/5, Astana, 010000, Kazakhstan
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ABSTRACT

Oil and oil products are among the main and widespread sources of pollution of water and terrestrial ecosystems. Accidents in oil production can pollute both water and soil ecosystem; in the latter, the pollution can change the soil structure and its redox potential, degrade living conditions of plants and animals, under mine trophic transfer, and block the natural oxygen cycle. A large number of oil fields are situated in the Kazakhstan Republic, especially in the western areas of the country. Oil production and transportation accidents occur regularly and have a severe and deleterious effect on the environment and on wildlife. Therefore, searching for effective bioremediation methods for water and soil is vital. Hydrocarbons can be degraded by microbial activity, for example, by fungal species that can use oil and oil products as a source of carbon and energy. The aim of our work is to characterize the ability of the microscopic fung us Aspergillus terreus 49/10-1 to degrade oil and oil products in soil and water. This strain was isolated from soil of the Caspian Sea and shows high efficiency in bioremediation of oil-contaminated water and soil. More than 89.5% of oil and oil products in water was degraded; in soil, more than 40% was degraded.

Keywords: microscopic fungi, IR spectrometry, degradation, oil

 

УДК 579.66

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ШТАММА МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ГРИБА ASPERGILLUS TERREUS 49/10-1 ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТИ

 

Жагипар Ф.С., Нечай Н.Л., Молдагулова Н.Б., Ягофарова А.Я., Бердимуратова К.Т., Какимжанова А.А.
Национальный центр биотехнологии,
Кургальжинское шоссе, 13/5, Астана, 010000, Казахстан
fariza
140292@mail.ru

 

АБСТРАКТ

Одним из главных и наиболее распространенных источников загрязнения водных и наземных экосистем являются нефть и нефтепродукты. Выбросы нефти загрязняют водные экосистемы и почвенный слой, изменяя структуру и окислительно-восстановительный потенциал, нарушая условия жизни растений и животных, разрушая пищевую цепь; блокируя круговорот кислорода в объектах окружающей среды. Ввиду того, что на территории Республики Казахстан, особенно в западной части, находятся нефтяные месторождения, аварийные разливы при добыче и транспортировке нефти и нефтепродуктов происходят регулярно, что отрицательно влияет на экологическую среду и жизнедеятельность живых организмов. Поэтому поиск эффективного способа биоремедиации воды и почвы является актуальным вопросом.

Основной вклад в процесс микробиологического разрушения углеводородов вносят микромицеты, способные использовать нефть и нефтепродукты в качестве источника углерода и энергии.

Целью настоящей работы является использование штамма микроскопического гриба Aspergillus terreus 49/10-1 для деструкции нефти и нефтепродуктов в воде и почве.

Степень деструкции углеводородов определяли методом ИК Фурье-спектрометрии.

Исследование нефтедеструктивных способностей штамма микроскопического гриба Aspergillus terreus 49/10-1, выделенного из почв Каспийской акватории РК, показало, что штамм обладает высокой эффективностью к биоремедиации загрязненной нефтью воды и почвы. При этом степень деструкции в случае воды составила 89,50%, в случае почвы – более 40%. Для доказательства воспроизводимости, точности и достоверности полученных результатов провели статистическую обработку данных. 

Ключевые слова: микроскопический гриб, ИК Фурье-спектрометрия, деструкция, нефть.


ВВЕДЕНИЕ

Нефть – это жидкое природное ископаемое, состоящее из большого числа высокомолекулярных углеводородов различного строения. В качестве эколого-геохимических характеристик основного состава нефти приняты содержание легкой фракции, метановых углеводородов (включая твердые парафины), циклических углеводородов, смол, асфальтенов и сернистых соединений. Легкая фракция нефти, находясь в почвах, водной или воздушной средах, оказывает наиболее токсическое воздействие на все живые организмы [1].

Влияние нефтяной промышленности в мировой экономике создает условия для распределения различных молекул углеводородов и огромного объема масляной густой грязи, которые являются канцерогенными и токсичными [2, 3]. Шлаки нефти и нефтепродуктов в почве в районах нефтедобычи являются серьезной экологической проблемой. Период самовосстановления растительного покрова после загрязнения почвы нефтью и нефтепродуктами длителен и для северных регионов, что составляет 15-20 лет [4, 5].

В Казахстане основными нефтедобывающими областями являются Атырауская, Западно-Казахстанская, Кызылординская, Актюбинская, а также Мангистауская области. В Атырауской области открыты и эксплуатируются нефтегазовые месторождения на суше Прорва, Узень, Жетыбай, Каламкас, Каражанбас, Бузачи, Кенбай, Королевское, Тенгиз, Каратон, Тажигали, Тереньозек, Мартыши, Камышовые, Карачаганак, Жанажол, Кенкияк, Алибек-мола и другие. Многие месторождения эксплуатируются более 90 лет [6].

Одну из важных сторон ремедиации загрязненной почвы нефтью выполняют микроорганизмы. Скорость их разложения обусловлена окислительно-восстановительными условиями, гидротермальным режимом, активностью микроорганизмов и рядом других условий [7].Самый рациональный путь очищения окружающей среды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами, использование методов, основанных главным образом на метаболической деятельности микроорганизмов [8].

Была дана оценкаспособности роста микроскопических грибов на углеводородах нефти[9]. Для этого авторы рассматривали рост выделенных из почвы изолятов грибов, в средах с содержанием различной концентрации керосина. Таким образом, Rhizopussp. показал высокий диаметр роста мицелия в 5% керосине, аAspergillusniger–в питательной среде с 20% керосина. Было отмечено, что культура, состоящая из Рenicilliumsp, Rhizopussp и Aspergillusterreus, показала самый высокий диаметр роста в 10% керосине.

Согласно исследованию, в котором нефть использовалась какединственный источник углерода и энергии для питания микроскопических грибов,установлено, что после 28 дней культивирования изолированного штамма микромицетаAspergillusniger,процент утилизации нефтяной концентрации составил 95%. Тогда как использование двух видов штаммов Aspergillus. nigerиAspergillusfumigatus в консорциуме показало 90% деструкции нефти, а в комплексе четырех штаммов грибов Aspergillusniger, Aspergillusfumigatus, Penicilliumfuniculosumи Fusariumsolani, процент употребления углеводородов нефти – 70% [10].

В данной работе рассматриваются результаты использования штамма микроскопического гриба Aspergillus terreus 49/10-1 по деструкции нефти и нефтепродуктов в почве и воде.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения исследований был использован штамм микроскопического гриба Aspergillus terreus 49/10-1, выделенныйиз почв Каспийской акватории. Для культивирования микромицета использовали питательную жидкую среду Чапека, нефть месторождения КаражанбасМангистауской области. Степень деструкции углеводородов определяли методом ИК Фурье-спектрометрии.

 

Метод анализа ИК спектрофотометрии

Метод заключается в выделении эмульгированных и растворенных нефтяных компонентов из воды, почвы и донных отложений экстракцией четыреххлористым углеродом, затем отделении нефтепродуктов хроматографией от сопутствующих органических соединений других классов на колонке, заполненной оксидом алюминия, и количественном их определении по интенсивности поглощения С-Н связей в инфракрасной области спектра [11, 12].

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Аспергиллы широко распространены в природе, они были выделены преимущественно из почвы гниющих растений и различных органических веществ. Хотя род Аspergillus содержит более 150 видов, лишь несколько считаются патогенными для человека [13]. Aspergillus terreus – это гриб, который широко распространен по всему миру, но более часто встречается в тропических и субтропических районах [14].

Углеводородокисляющую активность микроорганизма определяли путем культивирования на жидкой среде Чапека с добавлением глюкозы и фосфата аммония с внесением 1% (по массе) стерильной нефти и биомассы двухдневного штамма микромицета. Контролем в эксперименте служила нефтезагрязненная среда Чапека, соответственно, без внесения микроорганизмов. Деструкцию нефтепродуктов после культивирования с Aspergillus terreus49/10-1 определяли методом ИК Фурье-спектрометрии.

Штамм микроскопического гриба Aspergillus terreus49/10-1 культивировали на качалке при 120 об/мин в течение двух дней. На второй день роста микромицета добавили 1% нефть(плотность 0,8). Культивирование проводили до визуальногоуменьшения и частичного разрушения нефтяной пленки. Эксперимент проводили в трех повторностях.

Деструкция нефтепродуктов в случае штамма Aspergillus terreus49/10-1 на 15 день культивирования составила 89,5% по сравнению с контрольным образцом. Результаты представлены на рисунке 1.

Рис. 1. ИК спектры контрольного образца нефти и образца после обработки штаммом деструктором Aspergillusterreus 49/10-1
Fig. 1. IR spectra of control samples and samples after cultivation with oil oxidizing strains Aspergillus terreus 49/10-1
 
Рис. 1. ИК спектры контрольного образца нефти и образца после обработки штаммом деструктором Aspergillusterreus 49/10-1
Fig. 1. IR spectra of control samples and samples after cultivation with oil oxidizing strains Aspergillus terreus 49/10-1

 

Из рисунка 1 видно, что деструкция нефти значительна и составляет более 89,50% по сравнению с контрольными образцами. Была проведена статистическая обработка полученных данных для проверки воспроизводимости, достоверности и установления доверительных границ полученных результатов.

Деструктивную активность отобранного штамма микроскопического гриба Aspergillus terreus49/10-1 проверяли на почве, загрязненной нефтепродуктами. Степень загрязнения почвы составила 1% и 3,25%. Деструкцию нефтепродуктов определяли методом ИК Фурье-спектрометрии.

Штамм микроскопического Aspergillus terreus49/10-1 культивировали на качалке при 120 об/мин. в течение двух дней на жидкой среде Чапека с добавлением глюкозы и фосфата аммония. На второй день роста микромицета в почву добавили 1% (по массе) нефть, затем внесли пеллеты микроскопического гриба Aspergillus terreus49/10-1 в нефтезагрязненную почву. Контролем служила почва,загрязненная нефтепродуктами,без внесения микромицета. Эксперимент проводили в трех повторностях.

Отбор проб для анализа степени деструкции нефти методом ИК спектрометрии образцов почвы,загрязненной нефтепродуктами,проводили на 30-й день.

Результаты представлены на рисунке 2. Установлено, что контрольные образцы почвы с 1% загрязнением характеризуются темным цветом и характерным запахом нефтепродуктов.После 30 дней культивирования данной почвы со штаммом микроскопического гриба Aspergillusterreus49/10-1 наблюдали значительное осветление почвогрунта, более того, резкий запах нефтепродуктов в образцах отсутствует.

Рис. 2. ИК спектры контрольного образца нефти и образца после обработки штаммом деструктором Aspergillusterreus 49/10-1
Fig. 2. IR spectra of control samples and samples after cultivation with oil oxidizing strains Aspergillusterreus 49/10-1
 
Рис. 2. ИК спектры контрольного образца нефти и образца после обработки штаммом деструктором Aspergillusterreus 49/10-1
Fig. 2. IR spectra of control samples and samples after cultivation with oil oxidizing strains Aspergillusterreus 49/10-1

 

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что степень деструкции нефтепродуктов в образцах после культивирования с микроскопическим грибом Aspergillusterreus 49/10-1 составляет в среднем 43,33% по сравнению с контрольными образцами.

Была проведена статистическая обработка полученных данных для проверки воспроизводимости, достоверности и установления доверительных границ полученных результатов.

Далее, отобранный штамм использовали для очистки почвы со степенью загрязнения нефтепродуктом 3,25%. Результаты эксперимента приведены в таблице 1.

По визуальной оценке почвенных проб следует, что контрольные образцы нефтезагрязненной почвы с содержанием 3,25% нефти, по сравнению с образцами почвы после культивирования со штаммом микроскопического гриба Aspergillusterreus49/10-1, имеют интенсивный темный цвет и резкийзапах нефтепродуктов. После очистки почвы штаммом нефтедеструкторомнаблюдали осветление образцов без характерного запаха нефтепродуктов.

 

Таблица 1. Результат определения деструкции нефтепродуктов в почве методом ИК Фурье-спектрометрии в контрольных образцах и образцах после культивирования соштаммом Aspergillusterreus 49/10-1,со статистической обработкой данных
Table 1.The result of determination of degradation of oil products in the soil by IR spectrometry of control samples and samples after cultivation with oil oxidizing strains Aspergillus terreus 49/10-1 and statistical services

Наименование

образца

 

Denomination of sample

Масса нефте

продуктов, г/100г

 

Weight of oil products

Среднее значение массы нефтепродуктов, г/100г

 

Average value of weight of oil products g/100g

Относи

Тельное отклонение, S

 

Relative deviation, S

Относительно стандарт

Ное отклоне

ние, Sr%

 

Relative standard deviation, Sr %

Доверите

льная граница, г/100г

 

Confidenceenvelope, g/100g

Степень деструкцииА, %

 

Extent of destruction A, %

Контрольные образцы почвы

 

Controls

Oil samples

3,20

3,25

0,14

4,24

3,25±0,14

7,00

3,20

3,10

3,50

3,30

3,20

Образцы почвы после культивирования со штаммом Aspergillusterreus 49/10-1

 

Samples after cultivation with oil oxidizing strains Aspergillus terreus 49/10-1

1,50

1,68

0,13

7,90

1,68±0,14

48,08

1,70

1,70

1,60

1,90

1,70

Из данных таблицы 1 видно, что среднее содержание нефтепродуктов в контрольных образцах почвы составил 3,25г в 100г пробы, при этом значения относительного и относительно стандартного отклонений показывают,что полученные результаты характеризуются высокой воспроизводимостью и точностью, деструкция составляет 7,00%. В случае образцов почвы после культивирования нефти со штаммом микромицетаAspergillusterreus 49/10-1 среднее значение остаточных нефтепродуктов снизилось до 1,68г на 100г почвы, при этом исходя из значений отклонений можно сделать вывод о воспроизводимости и точности полученных результатов. Деструкция нефтепродуктов в опытных образцах в среднем составила 41,08%. Была найдена доверительная граница полученных результатов, которая не превышает 0,14.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 

Исследование нефтедеструктивных способностей штамма микроскопического гриба Aspergillus terreus 49/10-1, выделенного из почв Каспийской акватории РК, показало, что штамм обладает высокой эффективностью к биоремедиациинефтезагрязненной почвы и воды. При этом степень деструкции в случае воды составила 89,50%, в случае почвы – более 40%. Для доказательства воспроизводимости, точности и достоверности полученных результатов провели статистическую обработку данных. 

 

Финансирование

Работа выполнена в рамках проекта: «Разработка комплексного биологического препарата на основе углеводородокисляющих микроорганизмов для биоремедиации почв и воды» по бюджетной программе 055 «Научная и/или научно-техническая деятельность», подпрограмма 100 «Программно-целевое финансирование» на 2014-2016 гг. 

 

REFERENCES

 

  1. ShamrayevА.V., ShorinaТ.S. Vlijanieneftiinefteproduktovnarazlichnyekomponentyokruzhaiusheysredy [Influence of oil and oil products on various components of the environment]. ОGU,2009, no. 6 (100), pp. 642-645.
  2. Propst. T.L., Lochmiller R.L., Qualls Jr. C.W. and McBee K. In situ (mesocosm) assessment of immunotoxicity risks to small mammals inhabiting petrochemical waste sites. Chemosphere, 1999, no. 38, pp. 1049-1067.
  3. Ojumu T.V., Bello O.O., SonibareJ.A. and Solomon B.O. Evaluation of microbial systems for bioremediation of petroleum refinery effluents in Nigeria. Afr. J. Biotechnol., 2004, no. 4, pp. 31-35.
  4. Tereshchenko N.N., Lushnikov S.V., PeshevaE.V. Rekultivacijaneftezagrjaznennyhpochv [Remediation of the petropolluted soils].Ekologija I promyshlennostRossii–Еcology and industry of Russia, 2002,no.10, pp. 17-20.
  5. Kireeva N.A. Tishkina E.I. Uskoreniebiodestrukciineftjanyhzagrjaznenijprirekultivaciipochv [Acceleration of biodegradation of oil pollution in soil remediation].Aktualnyevoprosybiotehnologii–Aktualproblems of biotechnology. Ufa,1990, pp. 36-44.
  6. Zhmyhov A.A. Monitoring zemelAtyrauskoioblasti [Land Monitoring in Atyrau region]. AnaliticheskijobzorAtyrau: Atyrauskij TSNITI – Analytical summary of Atyrau: TSNITI of Atyrau, 2002.
  7. Soprunova O.B., Akzhigitov S.A., Kaziev A.A. Sposobyochistkipochvotzagrjaznenijaneftiu I nefteproduktami, primenjajamikrobnyebiotehnologii [Methods of cleaning soils from contamination with oil and oil products, using microbial biotechnology]. Molodoiuchenyj – A young scientist,2015,no. 7 (87), pp. 240-242. 
  8. Leahy J.G. and Colwell R.R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. Microbial Reviews,no. 54(3), pp. 427-450.
  9. Sakineh L., Gunale V.R., Rajurkar N.S. Assessment of petroleum hydrocarbon degradation from soil and tarball by fungi. Bioscience Discovery, 2012, no. 3 (2), pp. 186-192.
  10. IhsanFlayyih Hasan AI- Jawhari. Ability of Some Soil Fungi in Biodegradation of Petroleum Hydrocarbon. Journal of Applied & Environmental Microbiology,2014, vol. 2 (2),pp. 46-52.
  11. PND F 16.1:2.2.22-98.Kolichestvennyjhimicheskijanalizpochv. Metodikavypolnenijaizmerenijmassovoidolinefteproduktov v mineralnyh, оrganogennyh, organo-mineralnyhpochvahidonnyhotlozhenijahmetodom IK-spektrometrii [Quantitative chemical analysis of soils. Technique of execution of measurements of mass fraction of oil products in mineral, organogenic, organomineral soils and sediments by the method of IR spectroscopy]. Moscow, 1998.
  12. PND F 14.1:2:4.168-2000. Kolichestvennyjhimicheskijanalizvod.Metodikavypolnenijaizmerenijmassovoikoncentraciinefteproduktov v probahpitjevyh, prirodnyhiochishennyhstochnyhvodmetodomIK-spektrofotometrii s ispolzovaniemkoncentratomeraКN-2 [Quantitative chemical analysis of waters. Technique of execution of measurements of mass concentration of oil products in samples of drinking, natural and treated wastewater by the method of IR-spectrophotometry using concentratometer KN-2].Moscow, 2000.
  13. Sigler L., Verweij P. Aspergillus, Fusarium and other opportunistic moniliaceous fungi. In Manual of Clinical Microbiology / Ed. by P. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller& R.H. Yolken. Washington DC: American Society for Microbiology, 2003, pp. 1726-1739.
  14. Steinbach W.J., Perfect J.R., Schell W.A., Walsh T.J., Benjamin D.K. Jr. In vitro analyses, animal models, and 60 clinical cases of invasive Aspergillus terreus infection. Antimicrob Agents Chemother, 2004, no. 48(9), pp. 3217-3225.

 

МҰНАЙДЫ ДЕСТРУКЦИЯЛАУҒА ASPERGILLUS TERREUS 49/10-1 МИКРОСКОПИЯЛЫҚ САҢЫРАУҚҰЛАҚ ШТАММЫНЫҢ ҚОЛДАНЫСЫ

 

Жағыпар Ф.С., Нечай Н.Л., Молдағұлова Н.Б., Ягофарова А.Я., Бердімұратова Қ.Т., Кәкімжанова А.А.
Ұлттық биотехнология орталығы
Қорғалжын тас жолы 13/5, Астана, 010000, Қазақстан
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ТҮЙІН

Мұнай және мұнай өнімдері су және жер экожүйелерінің ластануының басты қайнар көзі болып табылады. Апатты мұнай шығарындылары судың және топырақтың үстіңгі қабатын ластап, оның құрылымын және тотығу-тотықсыздану потенциалын бұзып, өсімдіктер мен жануарлардың өмір сүру жағдайын қиындатады, қоректік тізбектің бұзылуы, сонымен қатар, қоршаған орта объектілерінде оттегі циклының бұғатталуы кездеседі. Қазақстан Республикасының, батыс бөлігінде, мұнай және мұнай өнімдерінің өндірілуі мен тасымалдануы экологиялық жағдайға және тірі организмдердің өмір сүру деңгейіне теріс әсерін тигізеді. Сондықтан да, биоремедиациялаудың тиімді әдістерін іздестіру өзекті мәселелердің бірі болып табылады.

Негізгі мәселе - мұнай өндіруші аймақтардың мұнай және мұнай өнімдерін тасымалдау кезінде көмірсутегі шикізатының апатты төгілуі болып табылады.

Микробиологиялық деструкция үрдісіне негізгі қызметті микромицеттер атқарады. Олар мұнай және мұнай өнімдерін көмірсутек көзі ретінде пайдалануға қабілетті.

Жұмыстың мақсаты су және топырақтағы мұнай және мұнай өнімдерін деструкциялау үшін Aspergillus terreus 49/10-1 микроскопиялық саңырауқұлағының штаммын қолдану болып табылады.

Көмірсутектер деструкциясының дәрежесі ИҚ Фурье спектрометр әдісі бойынша топырақтан және культуральды ертіндіден анықталды. Алынған нәтижелер мұнаймен ластанған су және топырақты тазалау үшін Aspergillus terreus 49/10-1  микроскопиялық саңырауқұлағының штаммының жоғары тиімділігін көрсетті. Құрамында 1% мұнайы бар культуральды ертіндіде Aspergillus terreus 49/10-1 микромицетінің штаммы 89,50% деструкцияны көрсетті. Топырақтағы 1% мұнай деструкциясы микроскопиялық Aspergillus terreus 49/10-1 саңырауқұлағымен 43,33%, ал 5% мұнаймен – 48,08% құрады. Осылайша, Aspergillus terreus 49/10-1 микроскопиялық саңырауқұлағы мұнаймен ластанған су және топырақ деструкциясында қолдануға болады

Негізгі сөздер: микроскопиялық саңырауқұлақ, ИҚ Фурье спектрометр, деструкция, мұнай

Dog