2/2017

 

ABSTRACT

The creation of an in vitro collection of aseptic plants is the first stage for preservation of genetic diversity of barberry in a cryobank and production of mother plantations in natural habitats.Seedlings and plantlets of barberry were obtained from seeds and cuttings, respectively,using biotechnological methodsto produce aseptic plants. Scarification and stratification is required for seeds of some species that are difficult to germinate in wet perlite. Treatment of explants with 0.1% HgCl2 for 8 min is optimal for in vitro culture and produces 46.4%regeneration.In vitro plants were tested for the presence of infection in a specialized 523 medium to detectbacteria and fungi. On average,44.5% of the in vitroshoots in all the tested accessions were affected by endophytic infection. The composition of the nutrient medium was optimized as Murashige-Skoog medium with 166 mg/l CaCl2, 3.7 g/l MgSO4·7H2O, 30 g/l sucrose, 0.8 mg/l 6-benzylaminopurine, 0.02 mg/l indolebutyricacid, 0.1 mg/l gibberellic acid, 2 mg/l calcium pantothenate, 1 mg/l ascorbic acid, 1.75 g/l gelrite, 4 g/l agar, pH 5.7. Amaximum multiplication factorof 4.3 and high quality of regenerated plants were obtained using the optimized medium. A biotechnological regulation was developed to obtain an in vitrocollection of barberry plants anda collection consisting of 51 accessions was created. This collection will serve as the basis for the creation of cryobank of Kazakhstan barberry germplasm and for international exchange of plant resources.


 

 

УДК 634.1/.7;602.6:59;602.6:612

 

ОПТИМИЗАЦИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ БАРБАРИСА

 

Ромаданова Н.В.,Махмутова И.А., Карашолакова Л.Н., Христенко А.А., Кушнаренко С.В.
Институт биологии и биотехнологии растений
Алматы, 050040, Казахстан
nata_
romadanova@mail.ru

 

АБСТРАКТ

Для сохранения генетического разнообразия барбариса в криобанке и создания маточников в естественных местах обитания на первом этапе требуется получить коллекцию асептических растений in vitro. Для выполнения поставленной задачи биотехнологическими методами получены проростки барбариса из семян и черенков. Для трудно прорастающих во влажном перлите семян некоторых видов требуется дополнительно провести скарификацию и стратификацию. Для введения в культуру in vitro оптимальна обработка эксплантов в 0,1% растворе HgCl2 в течение 8 мин, регенерация при которой составляет – 46,4%. Растения в культуре in vitro протестированы на наличие инфицированности на специализированной среде 523 для детекции бактерий и грибов. Проверка показала, что в среднем 44,5% побегов, введенных в культуру in vitro у всех исследуемых образцов, были поражены эндофитной инфекцией. Оптимизирован состав питательной среды: Мурасиге-Скуга с добавлением 166 мг/л CaCl2, 3,7 г/л MgSO4·7H2O, 30 г/лсахарозы, 0,8 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,02 мг/л индолил масляной кислоты, 0,1 мг/л гибберелловой кислоты, 2 мг/л пантотената кальция, 1 мг/л аскорбиновой кислоты, 1,75 г/л джелрайта, 4 г/л агара, рН 5,7, при котором получен максимальный коэффициент размножения – 4,3 и высокое качество регенерировавших растений. Разработан биотехнологический регламент получения коллекции растений барбариса in vitro, создана коллекция растений, состоящая из 51 образца.Полученная коллекция послужит основой для создания криобанка гермоплазмы барбариса Казахстана и для международного обмена растительными ресурсами.

Ключевые слова: барбарис, семена, побеги, микроклональное размножение, коллекция in vitro.


ВВЕДЕНИЕ

В Казахстане произрастает 8 видов барбариса, 2 из которых:барбарис илийский (Berberisiliensis М. Рор.) и барбарис каркаралинский (Berberis karkaralensisKornilova & Potapov)занесены в Красную книгуКазахстана[1-4].Проблема утраты биоразнообразия, сокращение тугайных лесов, вследствие изменения условий их произрастания, стала важной проблемой нарушения экологии. На данный момент уже более 90% тугайных лесов утеряно, оставшиеся площади находятся в неудовлетворительном состоянии. Принимаются различные программы по сохранению и восстановлению тугайных лесов вдоль рек Сырдарьи, Или, Таласа и других, а также гор Каратау [5]. С местным населением ведутся беседы для повышения осведомленности, на данных участках запрещена хозяйственная деятельность, однако общая численность лесов постоянно сокращается.

Барбари́с в Казахстане встречается в Зайсане, Алтае и Тарбагатае, Джунгарском, Заилийском и Кунгей Алатау, Чу-Илийских горах. Это в основном кустарники, плоды, листья, кора, древесина и коренья которых обладают различными полезными свойствами.Человек с незапамятных времен использует барбарис в лечебных целях, в питании, как краситель, дубильное вещество и т.д. [6-8].

Барбарис – экономически ценное растение, и поэтому важно сохранить его уникальные виды, находящиеся под угрозой исчезновения.В нашей стране,кроме естественных мест произрастания, некоторые виды барбариса содержатся лишь в ботанических садах и в частных коллекциях, что недостаточно обеспечивает надежное сохранение гермоплазмы. Недостатки традиционных приемов сохранения генетических ресурсов обусловили необходимость разработки биотехнологических методов сохранения генофонда барбариса. Анализ имеющихся литературных данных позволяет сделать заключение, что решение проблемы сохранения коллекций на современном этапе необходимо проводить с учетом применения всех наиболее прогрессивных технологий, в том числе и длительное сохранение генетического материала в криобанках [9-11].

Для создания криобанка апикальных меристем барбариса требуется достаточное количество растений in vitro. Поэтому на первоначальном этапе необходимо ввести растительный материал в культуру in vitro и размножить асептические растения[12-13]. Ранее нами был опубликован материал о результатах введения некоторых дикорастущих видов барбариса в культуру in vitro[14, 15]. Целью настоящей работыявлялась разработка биотехнологиимикроклонального размножения для массового получениярастительного материала и создание коллекцииасептических растений барбариса.

Образцы гермоплазмы барбариса, сохранённые в коллекции in vitro, послужат для проведения широкого спектра биологических исследований. Среди них, прежде всего, разработка надежной методологии сохранения генетических ресурсов в криобанках, особенно редких и исчезающих видов, с возможной последующей их реинтродукцией в естественные места обитания [16-17].

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследованияявлялись 73 образца черенков и плодов барбариса,собраных в разные периоды вегетации в ущелье Каскасу Сайрам-Угамского Национального парка, в пойме реки Большая Алматинка в ущелье Алмарасан Иле-Алатауского Национального парка, в ущелье Иссык Заилийского Алатау, в пойме реки Или в ущелье Кербулак, из коллекций в АО «Лесной питомник», Алтайского ботанического сада, и из Карагандинского Национального Университета: 1 форма барбариса амурского (Berberis amurensis Rupr.), 13 форм барбариса илийского (Berberis iliensis M. Pop), 1 формабарбариса корейского (Berberis koreana Palib.), 21 форма барбариса круглоплодного (Berberis sphaerocarpa Kar, et Kir), 1 форма барбариса монетовидного (Berberis nummularia Bge.), 1 форма барбариса обыкновенного (Berberis vulgaris L.), 2 формы барбариса продолговатого (Berberis oblonga (Regel) C.K.Schneid.), 1 форма барбариса сибирского (Berberis sibirica Pall.), 1 формабарбариса Тунберга (Berberis thunbergii DC.), 27 форм барбариса цельнокрайнего (Berberis integerrima Bunge), 2 гибрида барбариса оттавского (Berberis х ottawiensis Schneid), 2 сорта: барбарис оттавский “Суперба” (Berberis x ottawensis “Superba”) и барбарис Тунберга “Келлера” (Breberis thunbergii “Kelleriis”).

Черенки со спящими почками и плоды барбариса для транспортировки помещались в чистые полиэтиленовые пакеты. Сбор черенков проводили в феврале-марте, плодов –в августе-сентябре.

 

Получение проростков барбариса из семян

Для проращивания побегов использовали семена, которые очищали от мякоти плодов, обрабатывали раствором отбеливателя «Белизна», разбавленного 1:1 в течение 5 минут: а) проращивали в перлите при 25°С,освещенности40 µEm-2s-1, 16-часовомфотопериоде (рисунок 1А); б) стратифицировали во влажном перлите при 4°С в течение 8 недельпри освещенности10 µE·m-2s-1, 16-часовомфотопериоде (рисунок 1Б); в)проращивали семена в условиях invitroна среде Кнопа следующего состава: 1 г/л Ca(NO3)2, 0,25 г/л MgSO4•7H2O, 0,25 г/л KH2PO4, 0,125 г/л KCl, 27,8 мг/л FeSO4•7H2O, 37,3 мг/л Na2ЭДТА•2H2O, 1,75 г/л джелрата, 4 г/л агара, pH 5,7 (рисунок 1В)[18]; г) получали проростки из зародышей: семена на 16 часов помещали на мокрую вату, удаляли разбухшую семенную кожуру. Далее в стерильных условиях ламинар-бокса обрабатывали раствором «Белизны», разбавленного 1:1 в течение 10 мин, изолировали зародыш, который переносили на питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) с 30 г/л сахарозы, 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 0,1 мг/л гибберелловой кислоты ГК, 1,75 г/л джелрайта, 4 г/л агара, рН 5,7 (рисунок 1Г)[19].

А – проростки из семян Berberis integerrima во влажном перлите; Б – пророщенные семена Berberis sphaerocarpa формы 2 после стратификации во влажном перлите при +4°С, освещенности 10 µE·m-2s-1, 16-часовом фотопериодев течение 8 недель; В – проращивание побегов Berberis sphaerocarpa форма 12 в условиях invitroиз семян на питательной среде Кнопа; Г – получение побегов из зародышей Berberisvulgaris
Рис. 1. Получение проростков барбариса

А – seedlings of Berberis integerrima seeds in wet perlite; Б – germinated seeds Berberis sphaerocarpa Form 2 after stratification in wet perlite at +4°С, light 10 µE·m-2s-1, 16-hour photoperiod for 8 weeks; B – germination of Berberis sphaerocarpa in vitro shoots Form 12 from seeds on Knop nutrient medium; Г – obtaining seeds from Berberisvulgaris embryos
Fig. 1.Obtainingbarberryseedlings
 
А – проростки из семян Berberis integerrima во влажном перлите; Б – пророщенные семена Berberis sphaerocarpa формы 2 после стратификации во влажном перлите при +4°С, освещенности 10 µE·m-2s-1, 16-часовом фотопериодев течение 8 недель; В – проращивание побегов Berberis sphaerocarpa форма 12 в условиях invitroиз семян на питательной среде Кнопа; Г – получение побегов из зародышей Berberisvulgaris
Рис. 1. Получение проростков барбариса

А – seedlings of Berberis integerrima seeds in wet perlite; Б – germinated seeds Berberis sphaerocarpa Form 2 after stratification in wet perlite at +4°С, light 10 µE·m-2s-1, 16-hour photoperiod for 8 weeks; B – germination of Berberis sphaerocarpa in vitro shoots Form 12 from seeds on Knop nutrient medium; Г – obtaining seeds from Berberisvulgaris embryos
Fig. 1.Obtainingbarberryseedlings

 

Получение проростков барбариса из черенков

Черенки длиной 20-30 см срезали у однолетних побегов, промывали в мыльном растворе и проточной воде, затем в течение 5 мин обрабатывали разбавленным раствором отбеливателя «Белизна» (1:1) и промывали в проточной воде. Для стимуляции побегообразования из покоящихся почек черенки помещали в сосуды с водой(рисунок 2А). Через 2-4 недели получали проростки длиной 1-1,5 см, которые использовали для введения в культуру invitro.

 

Введение в культуру invitro побегов, полученных из семян и черенков

Нестерильные побеги, полученные проращиванием семян и черенков длиной 1-1,5 см, срезали и в ламинарном боксе стерилизовали в 0,1% растворе сулемы (HgCl2) в течение 8 мин. Верхушки побегов после стерилизации помещали в пробирки со средой МС, содержащей 30 г/л сахарозы с добавлением регуляторов роста: 0,5 мг/л БАП, 0,01 мг/л идолилмасляной кислоты (ИМК), 1,75 г/л джелрата, 4 г/л агара, рН 5,7 (рисунок 2Б).

 

Проверка растений на эндофитную микрофлору

Введённые в культуру invitroэкспланты были протестированы на отсутствие эндофитной инфекции на специализированной среде для роста бактерий и грибов 523, в состав которой входили: 10 г/л сахарозы, 8 г/л гидролизата казеина, 4 г/л дрожжевого экстракта, 2 г/л KH2PO4, 0,15 г/л MgSO4·7H2O, 6 г/лджелрайта, рН 6,9 [20]. Во время пересадки растений на свежую питательную среду срезали основания микропобега и помещали в чашки Петри на среду 523, культивировали при температуре 25°С в течение 1-2 недель. Среда состерильнымиэксплантами остается прозрачной, тогда как помутнение среды или рост колоний указывает на инфицированность микропобегов, которые следует сразу же отбраковывать (рисунок 2В).

А – проращивание черенков Berberis thunbergii в воде; Б – побег Berberis oblonga на питательной среде МС;  В – проверка растений на наличие инфицированности на среде 523
Рис. 2. Введение барбариса в культуру in vitro

А – germination of Berberis thunbergii cuttings in the water; Б – Berberis oblongashoot on MS nuitrient medium; B – testing of plants for the presence of infection on 523 medium

Fig. 2.Introduction of barberry into in vitro culture
 
А – проращивание черенков Berberis thunbergii в воде; Б – побег Berberis oblonga на питательной среде МС;  В – проверка растений на наличие инфицированности на среде 523
Рис. 2. Введение барбариса в культуру in vitro

А – germination of Berberis thunbergii cuttings in the water; Б – Berberis oblongashoot on MS nuitrient medium; B – testing of plants for the presence of infection on 523 medium

Fig. 2.Introduction of barberry into in vitro culture

 

Микроклональное размножение барбариса invitro

Были испытаны26 вариантов питательных сред на основе среды МС, только во 2 варианте использовали ½ концентрацию солей МС, в 3 варианте ¾ [19].Неизменными в питательной среде являлись: 30 г/л сахарозы, 1,75 г/л джелрайта, 4 г/л агара, рН 5,7. Остальные компоненты представлены в таблице 1.

Пробирочные растения выращивали в светокультуральной комнате при температуре 23-25°С, освещенности 40 µE·m-2s-1, 16-часовом фотопериоде пассировали на свежую питательную среду с интервалом 3-4 недели.

Коэффициент размножения (Кр)микрочеренков барбариса рассчитывался по формуле: Р=а/вс,где «а» – количество образовавшихся побегов, «в» – количество высаженных побегов; «с» – количество пассажей.

В экспериментах использовали 5побегов, в опыте проводили 3 повторности (n=15). Кр вычисляли через 3 пассажа. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым методикам, описанным в пособии Г.Ф. Лакина и в программном пакете SYSTAT [21-22].

 

Таблица 1. Состав питательной среды для размножения барбариса в культуре invitro
Table 1. Nutrient medium composition for barberry micropropagation

Вариант питательной среды

 

Variants of nutrient medium

Компоненты питательной среды, мг/л

 

Components of nutrient medium, mg/L-

MgSO4·7H2O

KH2PO4

FeSO4•7H2O

Na2ЭДТА•2H2O

CaCl2

6-бензиламинопурин

6-benzylaminopuri

Индолилмасляная кислота

Indole butyric acid

 

Гибберелловая кислота

Gibberellic acid

 

Аскорбиновая кислота

Ascorbic acid

Пантотенат кальция

Calcium pantothenate

1

-

-

-

-

-

0,5

0,01

-

-

-

2

-

-

-

-

-

0,5

0,01

-

-

-

3

-

-

-

-

-

0,5

0,01

-

-

-

4

-

-

-

-

-

0,5

0,01

1,0

-

-

5

-

-

-

-

-

0,5

0,01

2,0

-

-

6

-

-

-

-

-

0,5

0,02

0,1

-

-

7

-

-

-

-

-

0,5

0,02

2,0

-

-

8

-

-

-

-

-

0,5

0,01

3,0

-

-

9

-

-

-

-

-

0,5

0,05

1,0

-

-

10

-

-

-

-

-

0,5

0,05

2,0

-

-

11

-

-

-

-

-

0,5

0,05

3,0

-

-

12

-

-

-

-

-

0,8

0,02

2,0

-

-

13

-

-

-

-

-

1,0

0,02

2,0

-

-

14

-

-

-

-

-

0,8

0,02

0,1

1,0

-

15

-

-

-

-

-

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

16

-

-

27,8

37,3

-

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

17

-

-

27,8

37,3

332,0

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

18

-

-

-

-

332,0

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

19

-

-

-

-

166,0

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

20

-

-

13,9

18,7

166,0

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

21

-

-

7,0

9,3

166,0

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

22

370

-

-

-

166,0

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

23

370

170

-

-

166,0

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

24

370

170

7,0

9,3

166,0

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

25

185

85

7,0

9,3

166,0

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

26

185

85

-

-

166,0

0,8

0,02

0,1

1,0

2,0

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для получения проростков семена погружали во влажный перлит и проращивали в светокультуральной комнате в течение 1-4 недель. Лабораторная всхожесть образцов в среднем составила 66,6%. Однако выявлено, что семена Berberiskoreana,BerberissphaerocarpaиBerberisvulgaris практически не прорастают в вышеуказанных условиях (8,2%).Следует отметить, что покровы семян барбарисасостоят из трудно проницаемых для воды клеток. Главная причина задержки прорастания семян и сводится к тому, что вода не находит доступа к зародышу семени. В природе прорастание происходит под действием почвенных микроорганизмов, которые разрушают покровы. Поэтому для образцов, которые плохо прорастали, была проведенаскарификация – нарушение целостности оболочки семян с помощью надрезов, что повысило лабораторную всхожесть до 26,7%.

Также для того, чтобы приблизить условия прорастания семян к природным, а именно к смене времен года, было принято решение провести для этих образцов стратификацию.Кроме того, для этих образцов провелипроращивание семян в культуре invitro на питательной среде Кнопа и проращивание в культуре invitro зародышей. В результате лабораторная всхожесть плохо прораставших образцов барбариса после стратификации при температуре 4°С в течение 8 недель во влажном перлитеувеличилась в среднем до 78,8%. На среде Кнопа было отмечено в среднем 53,4% прорастания, у зародышей отмечали в среднем 73,3% образования побегов (рисунок 3).

a, b, c – значения, которые различаются достоверно между собой при р<0,05
Рис. 3. Результаты прорастания семян и зародышей барбариса

a, b, c – values that differ significantly between themselves at p<0,05
Fig. 3.Resultsofgerminationofbarberryseedsandembryos
 
a, b, c – значения, которые различаются достоверно между собой при р<0,05
Рис. 3. Результаты прорастания семян и зародышей барбариса

a, b, c – values that differ significantly between themselves at p<0,05
Fig. 3.Resultsofgerminationofbarberryseedsandembryos

 

Полученные нестерильные побеги из семян и черенков вводили в культуруinvitro.В среднем по образцамнаиболее оптимальной является обработка эксплантов в 0,1% растворе HgCl2 в течение 8 мин. При данной длительности стерилизации отмечен наименьший процент некроза побегов – 16,6% и инфицированности – 37,0%, процент регенерации составил – 46,4% (рисунок 4 и 5)[15]. При обработке в HgCl2 длительностью 3 мин отмечен высокий процент инфицированности – 78,9%, 10-минутная обработка дает высокий процент некроза – 59,4%.

a, b, c – значения, которые различаются достоверно между собой при р<0,05
Рис. 4. Результаты введения в культуру in vitro побегов барбариса,полученных из семян, длительность обработки в HgCl2 – 8 мин

a, b, c– valuesthatdiffersignificantlybetweenthemselvesatp<0,05
Fig. 4. Results of introduction of barberry shoots from seeds into in vitro culture, treatment time in HgCl2 – 8 min
 
a, b, c – значения, которые различаются достоверно между собой при р<0,05
Рис. 4. Результаты введения в культуру in vitro побегов барбариса,полученных из семян, длительность обработки в HgCl– 8 мин

a, b, c– valuesthatdiffersignificantlybetweenthemselvesatp<0,05
Fig. 4. Results of introduction of barberry shoots from seeds into in vitro culture, treatment time in HgCl– 8 min

 

a, b – значения, которые различаются достоверно между собой при р<0,01
Рис. 5. Результаты введения в культуру in vitro побегов барбариса,полученных из черенков, длительность обработки в HgCl2 – 8 мин

a, b – values that differ significantly between themselves at p<0,01
Fig. 5.Results of introduction of barberry shoots from cuttings into in vitro culture, treatmenttimeinHgCl2 – 8 min
 
a, b – значения, которые различаются достоверно между собой при р<0,01
Рис. 5. Результаты введения в культуру in vitro побегов барбариса,полученных из черенков, длительность обработки в HgCl– 8 мин

a, b – values that differ significantly between themselves at p<0,01
Fig. 5.Results of introduction of barberry shoots from cuttings into in vitro culture, treatmenttimeinHgCl2 – 8 min

 

Следующим наиболее важным этапом для успешного микроклонального размножения побегов in vitro служил контроль чистоты пробирочных растений на специализированной среде 523 для детекции бактерий и грибов. Проверка показала, что в среднем 44,5% побегов, введенных в культуру in vitro, у всех исследуемых образцов были поражены эндофитной инфекцией. При этом у барбариса круглоплодного – 54,7% побегов были поражены бактериальной инфекцией, у барбариса сибирского – 62,4%, когда как у барбариса илийского – 22,3%, у барбариса цельнокрайнего – 19,2%. Побеги, полученные из семян барбариса илийского формы 11, собранных в пойме реки Или в ущелье Кербулак, наличие инфекции не подтвердили, тогда как побеги, полученные из семян барбариса илийского формы 9, привезенные из АО «Лесной питомник», показали 38,8% заражения бактериальной инфекцией. В результате этих исследований можно сделать вывод, что наибольший процент инфицированности был обнаружен у побегов, полученных из семян, произраставших на освоенных человеком территориях, и, например, о полном отсутствии или небольшой инфицированности растений, произрастающих в трудно доступных местах. В дальнейшем для создания маточника, не пораженного бактериальной и грибной инфекцией, желательно подбирать места, удаленные от проживания и мест посещения человека.

Большое значение при введении в культуру in vitro и микроклональном размножении растений имеет состав питательной среды. Основным требованием к питательной среде является обеспечение высокого коэффициента размножения, т.е. максимальной регенерации растений из микрочеренков в минимальные сроки [12-13, 23-25]. В основном большое значение имеет соотношение фитогормонов и минеральных веществ в питательной среде. Были протестированы 26 вариантов состава питательных сред для барбариса илийского и барбариса цельнокрайнего, коэффициент размножения на этих вариантах питательных сред представлен в таблице 2.

 

Таблица 2.Влияние состава питательной среды на коэффициент размножения барбариса в культуре invitro
Table 2. Influence of nutrient medium composition on in vitro barberry multiplication factor

Вариантпитательнойсреды

 

Nutrientmediumvariants

Кол-вокультиви

руемыхэксплан

тов, шт.

 

Number of cultivated explants, pcs.

Кол-во

регенерировавших побегов через 3 пассажа, шт.

 

Number of regenerated shoots through 3 passages, pcs.

Среднее значение Коэффициент

размножения,

Р=а/вс

 

Mean

Multiplication factor,

Р=а/вс

Кол-вокультиви

руемыхэксплан

тов, шт.

 

Number of cultivated explants, pcs.

Кол-во

регенерировавших побегов через 3 пассажа, шт.

 

Number of regenerated shoots through 3 passages, pcs.

Среднее значение Коэффициент

размножения,

Р=а/вс

 

Mean

Multiplication factor,

Р=а/вс

Berberisiliensis Form4

Berberis integerrima Form 7

1

15

52

1,1±0,3a

15

64

1,4±0,2a

2

15

43

0,9±0,3a

15

52

1,2±0,2ac

3

15

54

1,5±0,6abc

15

66

1,5±0,4ab

4

15

47

1,0±0,3a

15

55

1,2±0,2ac

5

15

48

1,1±0,2a

15

44

1,0±0,2ac

6

15

69

1,5±0,4abc

15

89

2,0±0,2b

7

15

64

1,4±0,3аc

15

68

1,5±0,3аb

8

15

54

1,2±0,1a

15

66

1,5±0,4ab

9

15

45

1,2±0,1a

15

52

1,1±0,2ac

10

15

47

1,1 ±0,2a

15

67

1,5 ±0,3ab

11

15

40

0,9±0,2a

15

43

1,0±0,1c

12

15

98

2,2±0,3b

15

107

2,4±0,2bd

13

15

85

1,9±0,3bc

15

105

2,3±0,2bd

14

15

77

1,7±0,0c

15

89

2,0±0,4b

15

15

109

2,4±0,1b

15

123

2,8±0,3d

16

15

114

2,5±0,1b

15

125

2,8±0,3d

17

15

103

2,3±0,9bd

15

123

2,8±0,1d

18

15

152

3,4±0,1de

15

158

3,5±0,2e

19

15

122

2,7±0,4d

15

152

3,4±0,4de

20

15

157

3,5±0,2e

15

167

3,7±0,2ef

21

15

166

4,3±0,3f

15

188

4,2±0,3f

22

15

170

3,8±0,4ef

15

178

4,3±0,3f

23

15

101

2,6±0,5e

15

121

2,7±0,5de

24

15

109

2,7±0,5de

15

119

2,6±0,4de

25

15

90

2,4±0,3e

15

110

2,4±0,4bd

26

15

130

3,1 ±0,5bdc

15

120

2,7±0,3bd

Примечание – значения Р, обозначенные разными буквами, достоверно различаются между собой при р ≤ 0,01

Note – Р values marked with various letters differ significantly between themselves at р≤ 0,01

 

В результате показано, что оптимальная концентрация ИМК в питательной среде составляет 0,02 мг/л. Увеличение концентрации ИМК до 0,05 мг/л приводило к набуханию оснований микропобегов, а на отдельных образцах происходил каллусогенез и ризогенез.

Испытано три концентрации БАП – 0,5 мг/л, 0,8 мг/л и 1,0 мг/л в питательной среде. Было выявлено, что уже незначительное увеличение этого фитогормона до 0,8 мг/л способствует появлению дополнительных побегов. Увеличение концентрации хелата железа, а также добавление в питательную среду АК и пантотената кальция благоприятно повлияло на внешнее состояние растений, интенсивность их окраски, уменьшало количество выделяемых фенольных веществ, витрифицированных побегов и некрозов.

В результате выявлено, что для барбариса илийскогои барбариса цельнокрайнего наиболее высокий Кр был на питательных средах: №18, 20, 21, 22. Наиболее оптимальной является питательная среда №21, коэффициент размножения на которой был максимальным для обоих образцов.

Кроме того, было проведено сравнение качества регенерировавших растений на всех вариантах питательных сред. Для этого побеги культивировали по 5 штук на определенном варианте питательной среды (рисунок 6А, 6Б). Учитывали по баллам качество растений: количество, цвет, длина, ширина листьев и побегов, а также наличие некроза, каллуса, фенолов, выделяемых в среду (рисунок 6В, 6Г).

А – побеги в мадженте на питательной среде №17; Б – побеги в мадженте на питательной среде №22; В – изолированные побеги на питательной среде №17; Г – изолированные побеги на питательной среде №22
Рис. 6. Оптимизация состава питательных сред для Berberis iliensis форма 4 (растения 3-недельного срока культивирования)

А – shoots in a box on №17 nutrient medium; Б – shoots in a box on №22 nutrient medium; В – isolated shoots on №17 nutrient medium; Г – isolated shoots on №22 nutrient medium
Fig. 6.OptimizationofthenutrientmediacompositionforBerberis iliensisForm 4 (3 weekscultivationplants)
 
А – побеги в мадженте на питательной среде №17; Б – побеги в мадженте на питательной среде №22; В – изолированные побеги на питательной среде №17; Г – изолированные побеги на питательной среде №22
Рис. 6. Оптимизация состава питательных сред для Berberis iliensis форма 4 (растения 3-недельного срока культивирования)

А – shoots in a box on №17 nutrient medium; Б – shoots in a box on №22 nutrient medium; В – isolated shoots on №17 nutrient medium; Г – isolated shoots on №22 nutrient medium
Fig. 6.OptimizationofthenutrientmediacompositionforBerberis iliensisForm 4 (3 weekscultivationplants)

 

В результате максимально качественными растениями по сумме баллов были побеги барбариса илийского, культивируемого на питательной среде: №20, 21, 22, 23; и барбариса цельнокрайнего, культивированного на питательных средах: №18, 20, 21, 22. Статистический анализ не выявил достоверных различий между вариантами питательных сред: №21 (Кр 4,3), №22 (Кр 4,2), которые оптимальны для обоих образцов, однако Кр несколько выше на питательной среде №21.

В результате проведенной работы создана коллекция растений барбариса in vitro, состоящая из 51 образца(рисунок7) иразработан биотехнологический регламент получения коллекции растений барбариса in vitro(рисунок 8).

А – растения Berberis integerrima; Б – коллекция асептических растений барбариса in vitro
Рис. 7. Развитие барбариса в светокультуральной комнате (24°С, освещенность 40 µмол•м-2•с-1, фотопериод 16/8 ч)

А – Berberis integerrima plants; Б – in vitro collection of barberry aseptic plants
Fig. 7. Development of barberry in a growth room (24°С, light 40 µмол•м-2•с-1, photoperiod 16/8 h)
 
А – растения Berberis integerrima; Б – коллекция асептических растений барбариса in vitro
Рис. 7. Развитие барбариса в светокультуральной комнате (24°С, освещенность 40 µмол•м-2•с-1, фотопериод 16/8 ч)

А – Berberis integerrima plants; Б – in vitro collection of barberry aseptic plants
Fig. 7. Development of barberry in a growth room (24°С, light 40 µмол•м-2•с-1, photoperiod 16/8 h)

 

Рис. 8.Биотехнологический регламент получения коллекции растений барбариса in vitro
Fig. 8.Biotechnologicalregulationforinvitrobarberryplantcollection
 
Рис. 8.Биотехнологический регламент получения коллекции растений барбариса in vitro
Fig. 8.Biotechnologicalregulationforinvitrobarberryplantcollection

 

Полученная коллекция послужит основой для создания криобанка гермоплазмы барбариса Казахстана при температуре -196°С, коллекция может быть также использована в селекционном процессе по улучшению существующих и созданию новых сортов и для международного обмена растительными ресурсами.

 

ВЫВОДЫ

1. Для получения проростков барбариса можно использовать:1) семена, пророщенные в перлите, и в условиях in vitro на среде Кнопа;2) зародыши, пророщенные в условияхin vitro на питательной среде МС;3) черенки, пророщенные в воде. Лабораторная всхожесть семян в среднем по образцам составила 66,6%. Для трудно прорастаемых семян рекомендовано дополнительно провести скарификацию и стратификацию.

2. Для стерилизации растительного материала при введении в культуру in vitro оптимальна обработка эксплантов в 0,1% растворе HgCl2 в течение 8 мин. При данной длительности стерилизации отмечен высокий процент регенерации побегов – 46,4%.

3. Для получения асептической коллекции in vitro требуется контроль чистоты пробирочных растений на специализированной среде 523 для детекции бактерий и грибов. Проверка показала, что в среднем 44,5% побегов, введенных в культуру in vitro, визуально инфицированность которых не проявлялась, были поражены эндофитной инфекцией.

4. Оптимизирован состав питательной среды для микроклонального размножения побегов барбариса, наиболее оптимальной является среда МС+166 мг/л CaCl2, 3,7 г/л MgSO4·7H2O, 30 г/лсахарозы, 0,8 мг/л БАП, 0,02 мг/л ИМК, 0,1 мг/л ГК, 2 мг/л ПК, 1 мг/л АК, 1,75 г/л джелрайта, 4 г/л агара, рН 5,7. На этом варианте питательной среды были получены качественные растения и максимальный коэффициент размножения.

5. Разработан биотехнологический регламент получения коллекции растений барбариса in vitro, создана коллекция, состоящая из 51 образца.

 

Финансирование

Работа выполнена в рамках проекта 1783/ГФ4 «Разработка технологии криогенного сохранения гермоплазмы ценных видов и форм барбариса – источника биологически активных веществ». По бюджетной программе: 217 «Развитие науки», подпрограмме 102 «Грантовое финансирование научных исследований».

 

REFERENCES

 

  1. Illyustrirovannyy opredelitel' rasteniy Kazakhstana. [Illustrated determinant of Kazakhstan plants].Alma-Ata: Nauka, 1969, vol. 1, 644 p.
  2. Kulik K.N. Agrolesomeliorativnoye kartografirovaniye i fitoekologicheskaya otsenka aridnykh landshaftov [Agroforestal mapping and phytoecological evaluation of arid landscapes].Volgograd, 2004, 248 p.
  3. Mukhitdinov N.М., AmetovА.А., AbidkulovaК.Т., YdyrysА. Nekotoryye fitotsenoticheskiye osobennost ipopulyatsiy BerberisiliensisM.Pop.[Some phytocenotic features of populations of BerberisiliensisM.Pop]. Reporter of the Issyk-Kul University, 2010, no. 27, pp. 233-237.
  4. Krasnaya kniga Kazakhskoy SSR.[Red Book of the Kazakh SSR]. Part 2: Plants. Alma-Аta, 1981, 284 p.
  5. http://www.wwf.ru/about/where_we_work/asia/kazakh/eng.
  6. IbragimovI.I., DzhumabayevТ.Z. Stimuliruyushcheye deystviye na sistemu svertyvaniya krovi barbarisa prodolgovatogo i barbarisa monetnogo, proizrastayushchikhv Uzbekistane [Stimulating effect of Berberisoblonga and Berberisnummularia on the blood clotting system growing in Uzbekistan].Tashkent, 1971, 186 p.
  7. Mokhber-Dezfuli N., Saeidnia S., Gohari A.R., Kurepaz-Mahmoodabadi M. Phytochemistry and Pharmacology of Berberis Species.Pharmacogn Rev., 2014,vol. 8(15), pp. 8-15.
    CrossRef
  8. Hosseinzadeh H., Ramezani M., Shafaei H., Taghiabadi E. Anticonvulsant effect of Berberisintegerrima L. root extracts in mice.Journal Acupunct Meridian Stud., 2013,vol. (1),pp. 12-7.
    PubMedCrossRef
  9. PopovA.S.Kriogennoye khraneniye kul'tur kletok rasteniy [Cryogenic storage of plant cell cultures].Kultura kletok rasteniy. – M.,Nauka, 1981, pp. 150-162.
  10. Reed B.M. The basics of in vitro storage and cryopreservation. National Clonal Germplasm Repository, Corvallis, O.R. USA, 2002, pp. 34-46.
    CrossRef
  11. Seeds for Our Future. The U.S. National Plant Germplasm System.United States Department of Agriculture, Agricultural Research Serv, 1996, 20 p.
  12. Dhar S., Sharma Y.P., Wakhlu A.K. In Vitro Plant Regeneration System for Berberislycium using cotyledonary node explant.Journal of Tropical Medicinal Plants., 2012,vol. 13, I. 1, pp. 51-55.
  13. Shornikov D.G., Bryukhina S.A., Muratova S.A., Yankovskaya M.B., Papikhin R.V. Optimizatsiya usloviy kul'tivirovaniya invitro yagodnykh I dekorativnykh kul'tur. Vestnik Tambovskogo universiteta. Seriya: Yestestvennyye I tekhnicheskiye nauki, 2010,vol. 15(2),ss. 640-645.
  14. RomadanovaN.V., MishustinaS.A., KarasholakovaL.N., AralbayevaM.M., KabulovaF.D., AbidkulovaK.T., KushnarenkoS.V. Vvedeniye v kul'turu invitro dikorastushchikh vidov Berberisflory Kazakhstanai Uzbekistana [Introduction of wild Berberis species of Kazakhstan and Uzbekistan flora into in vitro culture].VestnikKaz NU named after al-Farabi, seriyabiologicheskaya, 2015,№3(65), pp. 346-354.
    CrossRef
  15. Romadanova N.V., Mishustina S.A., Karasholakova L.N., Aralbayeva M.M., Rakhimbayev I.R., Kushnarenko S.V. Sozdaniye kollek tsi i invitro dikorastushchikh vidov Berberis sp.Byulleten' GNBS, 2016,vyp. 121, pp. 69-76.
  16. Lynch P.T., Benson E.E., Harding K. Climate change: the role of ex situ and cryo-conservation in the future security of economically important, vegetatively propagated plants.J. Horticultural Science & Biotechnology, 2007,vol. 82, no. 2, pp. 157-160.
    CrossRef
  17. Engelmann F. Use of biotechnologies for the conservation of plant biodiversity.In Vitro Cellular & Developmental Biology, 2011,vol. 47, no. 1, pp. 5-16.
    CrossRef
  18. Knop W. Quantitative utersuchungenüber den ernährungensprozeb der pflanze.Landw.Versuchssat, 1865, vol. 7, pp. 93.
  19. Murashige T. and Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol Plant, 1962,vol. 15,pp. 473-479.
  20. Viss P.R., Brooks E.M., Driver J.A. A simplified method for the control of bacterial contamination in woody plant tissue culture.In Vitro Cell. DevelopmentBiol., 1991,vol. 27,pp. 42.
  21. .Lakin G.F. Biometriya: Uchebnoyeposobiyedlya biol. spets. vuzov[Textbook for Biological Specialized Institutes of Higher Education]. 4-ye izd.,pererab. idop. M.,Vyssh.shkola, 1990, 352 p.
  22. SYSTAT (2007) SYSTAT 12.0, SYSTAT Software, Inc, San Jose, CA, pp. Statisticssoftware.
  23. TruskinovE.V. Kultura invitro kak sovremennyy sposob vosproizvedeniya, sokhraneniya i introduktsii vegetativno razmnozhayemykh rasteniy[In vitro culture as a modern method to reproduct, preservation and the introduction of vegetatively propagated plants].Biol. divers.Introduction of plants. St. Petersburg, 2007, pp. 85.
  24. Kalinin F.L., Sarnatskaya V.V., PolishchukYe.Ye. Metodykulturytkaney v fiziologiii biokhimii rasteniy [Methods of tissue culture in plant physiology and biochemistry].Kiyev, Nauk. Dumka, 1980, 88 p.
  25. Arena M.E., Pastur G.M., Vater G. In vitro propagation of Berberisbuxifolia Lam.Biocellissn., 2000, vol. 24 (1), pp. 73-80.
    PubMed

 

БӨРІҚАРАҚАТТЫ МИКРОКЛОНДЫ КӨБЕЙТУ ӘДІСІН ЖЕТІЛДІРУ

 

Ромаданова Н.В.,Махмутова И.А., Қарашолақова Л.Н., Христенко А.А., Кушнаренко С.В.
Өсімдіктер биологиясы және биотехнологиясы институты
Тимирязев к-сі, 45, Алматы, 050040

nata_romadanova@mail.ru

 

ТҮЙІН

Бөріқарақаттың генетикалық алуантүрлілігін криобанкте сақтау және табиғи өсу ортасында аналық жатындарын құру үшін бірінші сатысында in vitroасептикалық өсімдіктер коллекциясын алу қажет. Алға қойылған міндетті орындау үшін биотехнологиялық әдістермен бөріқарақаттың тұқымдары мен өркендерінен өскіндер алынды. Ылғалды перлитте қиын өнетін кейбір түрлердің тұқымдары үшін қосымша скарификация және стратификация жүргізілуі қажет. In vitroкультурасына экспланттарды енгізу үшін регенерация 46,4% құраған HgCl20,1% ерітіндісінде 8 мин бойы өңдеу оптималды болды. In vitro культурасындағы өсімдіктер бактериялар мен саңырауқұлақтарды анықтауға арналған арнайы 523 қоректік ортасында тексеруден өткізілді. Тексеру in vitro культурасына енгізілген барлық зерттелген үлгілердің орта есеппен 44,5% өркендері эндофитті инфекциямен зақымдалғанын көрсетті. Көбеюдің ең жоғары коэффициенті – 4,3 және регенерацияға ұшыраған жоғары сапалы өсімдіктер алынған қоректік ортаның құрамы таңдалды: 166 мг/л CaCl2, 3,7 г/л MgSO4·7H2O, 30 г/лсахароза, 0,8 мг/л 6-бензиламинопурин, 0,02 мг/л индолил май қышқылы, 0,1 мг/л гибберелл қышқылы, 2 мг/л кальций пантотенаты, 1 мг/л аскорбин қышқылы, 1,75 г/л джелрайт, 4 г/л агар қосылған, рН 5,7 болатын Мурасиге-Скуг қоректік ортасы. Бөріқарақаттың in vitro өсімдіктер коллекциясын алудың биотехнологиялық регламенті жасалды, 51 үлгіден тұратын өсімдіктер коллекциясы құрылды. Коллекция Қазақстанның бөріқарақатының гермоплазма криобанкін құруда және өсімдік ресурстарымен халықаралық алмасуда негіз болады.

Негізгі сөздер: бөріқарақат, тұқымдар, өркендер, микроклонды көбейту, коллекция in vitro

Dog