2/2016

 

УДК 619:578.821.21:573.6.083:57.083.3

 

БАКТЕРИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ВИРУСА ОСПЫ ОВЕЦ, КОДИРУЮЩИХ АНТИГЕННЫЕ БЕЛКИ SPPV095 И SPPV141, ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ

 

Тайлакова Э.Т., Червякова О.В.
Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности
п.г.т. Гвардейский, Кордайский район, Жамбылская область, 080409, Казахстан

tailakova_86@mail.ru

 

АБСТРАКТ

Вакцинация является эффективным средством предупреждения распространения инфекционных заболеваний, что делает актуальным совершенствование существующих профилактических препаратов. В последнее время широко используются при разработке профилактических препаратов рекомбинантные белки, обладающие антигенными и иммуногенными свойствами. Целью данных исследований являлось получение рекомбинантных белков вируса оспы овец для разработки субъединичной вакцины против оспы овец, вспышки которой в последние годы все чаще регистрируются в республике и представляют угрозу для развития животноводства.

В результате проведенных исследований определены оптимальные условия экспрессии генов вируса оспы овец sppv-095 и sppv-141 в бактериальной системе. Установлено, что максимальное количество рекомбинантных белков нарабатывалось при инкубировании штаммов-продуцентов при 37°С в течение 4 часов после индукции 0,5 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в конечной концентрации для гена sppv-095 и при инкубировании при 25°С и 0,25 мМ ИПТГ для гена sppv-141.

Экспрессия рекомбинантных белков была подтверждена методом иммуноблотинга с использованием сыворотки к полигистидину. Рекомбинантные белки взаимодействовали в серологических реакциях с антителами, полученными к вирусу оспы овец, что подтвердило сохранение их специфической антигенной активности при экспрессии в прокариотической системе.

Полученные рекомбинантные белки будут использованы для разработки профилактических препаратов.

Ключевые слова: рекомбинантный белок; клонирование; экспрессия; индукция; вирус оспы овец.


ВВЕДЕНИЕ

Оспа овец – это тяжелое, высококонтагиозное заболевание, которое, согласно МЭБ (международное эпизоотическое бюро), относят к особо опасным болезням животных [1, 2]. Заболевание наносит овцеводству огромный экономический ущерб, слагающийся из гибели и вынужденного убоя больных животных, снижения продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных и охранно-карантинных мероприятий.

Решающая роль в борьбе с инфекционными болезнями животных отводится специфической профилактике.В настоящее время для профилактики оспы овец вреспубликах Казахстан, Кыргызстан и Российской Федерации используют культуральную вакцину, полученную на основе аттенуированного вируса оспы овец (ВОО), штамм «НИСХИ» [3, 4]. Однакоограничения на использование живых аттенуированных вакцин в районах, благополучных по данному заболеванию, и их недостатки,такие какреактогенность [5],риск остаточной вирулентности, возможная генетическая нестабильность, приводящая к возвращению патогенных свойств, биологическая нестабильность при хранении, а такжеаллергенное воздействие на некоторых вакцинируемых [6-9],создают необходимость разработки профилактических препаратов нового поколения.

Последним достижением молекулярной биологии, генной инженерии и биотехнологии стало создание вакцин нового поколения, содержащих высокоиммуногенные вирусные белки. Субъединичные вирусные вакцины представляют собой отдельный поверхностныйпротективный белок или набор белков. Обладая протективной активностью, эти антигены способны обеспечить развитие устойчивости иммунизируемого организма к последующему инфицированию. Достоинства данного типа вакцин состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствует живой вирус, что исключает выделение вируса в окружающую среду, снижая биологическую опасность. Также в этом препаратеотсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызывать нежелательные побочные эффекты в организме-хозяине. Последнее указывает нанизкуюреактогенностьвакцин данного типаиобуславливает их применение в медицине и ветеринарии [6, 10].

Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы является получение рекомбинантных белков вируса оспы овец для разработки высокоэффективных средств специфической профилактики инфекции.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и плазмиды

Для экспрессии генов целевых белков использовали клетки E. coli штамма Т7 (NewEngland Biolabs, Ipswich, MА USA), трансформированные рекомбинантными плазмидами рSPPV095 и pSPPV141∆ТМ (N(6)-C(184), полученные на основе вектора рЕТ26(b+) (Novagen, LaJolla, CA USA) [11]. Гены sppv095 (GenBank ID:NP_659667) и sppv141(GenBank ID:NP_659711) были амплифицированы методом ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной вирусной ДНК. После обработки рестриктазами NdeI –NotI фрагменты ДНК были клонированы по соответствующим сайтам в вектор рЕТ26(b+). Корректность нуклеотидных последовательностей была подтверждена секвенированием.

Оптимизация экспрессии рекомбинантных белков

Для определения оптимальной посевной концентрации в колбу со средой LB-kan (50 мкг/мл) вносили ночную культуру в следующих соотношениях: 1:20, 1:50 и 1:100, после чего инкубировали на шейкере при 37°C до OD600=0,6-0,8 ОЕ. Экспрессию индуцировали ИПТГ (изопропил-β-D-тиогалактопиранозид) в конечной концентрации 1мМ. Каждые 30 мин отбирали пробы по 1 мл, клетки осаждали центрифугированием 16000g 5 мин. Далее осадок ресуспендировали в 2× буфере для образцов и анализировали в ДСН-ПААГ (додецилсульфат натрия-полиакриламидный гель) электрофорезе.

Для определения оптимальной температуры экспрессии и концентрации индуктора клетки выращивали в 50 мл среде LB-kan (50 µg/ml) при 37°C до OD600=0,6-1. Суспензию делили на равные по объему части, затем клетки индуцировали ИПТГ в конечной концентрации 1 мМ, 0,5 мМ, 0,25мМ и продолжали инкубировать при 37°C, 30°C, 25°C, 18°C в течение 4 часов. Клетки собирали центрифугированием и анализировали методом электрофореза в ДНС-ПААГ.

Очистка рекомбинантных белков

Растворимость рекомбинантных белков определяли с использованием реагента BugBuster MasterMix (Novagen, SanDiego, CAUSA) по инструкции производителя [12].

Рекомбинантные белки в бактериальных клетках формировали тельца включения, которые очищали следующим образом: осадок клеток ресуспендировали в буфере (50мМ NaH2PO4, 10мМ ТрисНСl pH 8.0, 500мМ NaCl) из расчета 5мл на 1г сырого клеточного осадка. К полученной суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 1 мг/мл, инкубировали во льду в течение 30 минут и обрабатывали ультразвуком. Далее центрифугировали при 10000 g, 4°C, в течение 30 минут. Осадок промывали исходным буфером, хранили при -20°C. Дополнительную очистку включений проводили в денатурирующих условиях с использованием Ni-NTAагарозы(Invitrogen, Carlsbad, CAUSA) по протоколу производителя [13].Для солюбилизации клеточных включений использовали буферB [50мМ NaH2PO4, 300мM NaCl, 8М мочевинa, рН 7,8]. Отмывку проводили буфером C [50мМ NaH2PO4, 300мM NaCl, 8М мочевинa, рН 6,0]. Белки элюировали буфером Е [50мМ NaH2PO4, 300мM NaCl, 8М мочевинa, рН 4,0].

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) и вестерн-блот

Электрофоретическое разделение белков проводили в 15% ДСН-ПААГ в денатурирующих редуцирующих условиях по Laemmli [14]. Для визуализации белков использовали окрашивание Coomassie G-250 или иммунодетекцию. Для иммунодетекции белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и детектировали с помощью антител к anti-His (Cterm)/AP antibody (Invitrogen, Carlsbad, CAUSA) или сывороткой, полученной от овец, экспериментально инфицированных ВОО. Нитроцеллюлозную мембрану блокировали в течение 1 ч. при комнатной температуре с использованием буфера ББ [150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 5% обезжиренное сухое молоко]. Затем мембрану инкубировали с антителами к anti-His (Cterm)/AP antibody, меченными щелочной фосфатазой, в разведении 1:2000. Отмывали буфером TBST(150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,1% твин-20) трижды по 10 мин. После чего добавлением субстрата BCIP/NBT (Invitrogen, Camarillo, CAUSA) визуализировали белки.

В случае использования анти-ВООантител (1:10000) мембрану обрабатывали вторичными антителами Anti-SheepIgG/AP antibody (Sigma-Aldrich, St. Louis, MOUSA) в разведении 1:20000.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На сегодняшний день наиболее изученным представителем поксвирусов является вирус осповакцины штамм «Копенгаген». Установлено, что поксвирусы формируют несколько инфекционных форм вирионов, в число которых входит внеклеточный зрелый вирион (EEV-external enveloped virion) и внутриклеточный зрелый вирион (IMV-intracellular mature virion) [15]. EEV имеет двухслойную липидную оболочку, в которой, наряду с остальными белками, идентифицирован иммуногенный белок B5. Данный белок является мембранным гликопротеином I типа и имеет схожие характеристики с белками, регулирующими систему комплемента. Кроме того, белок B5 необходим при упаковке IMV для формирования внутриклеточного зрелого вириона (IEV-intracellular enveloped virion). Существуют данные, показывающие, что белок В5 имеет большое значение для правильного гликозилирования белков внеклеточного зрелого вириона EEV и зрелого вириона, ассоциированного с клеткой (CEV-cell-associated enveloped virion) [16].

Экспериментально установлено что мыши, иммунизированныебелкомВ5 вируса осповакцины, приобретают невосприимчивость к поксвирусной инфекции [17]. Также показано, что антитела к белку В5 проявляют вируснейтрализующую активность по отношению к EEV осповакцины. Следует также отметить, что удаление гена B5R снижает потенциал рекомбинантных вирусов для их использования при разработке противооспенных вакцин [18].

Наряду с поверхностными белками, иммуногенной активностью обладают внутренние белки вируса оспы. Белок A4 локализован с шипами выступами на ядре IMV и функционирует в качестве линкерного протеина, подобного матрице между ядром и двумя внутренними мембранами, окружающих IMV [19]. Коровий белок A4, обладающий иммуногенной активностью, вызывает образование нейтрализующих вирус оспы антител в организме иммунизированных животных и может быть использован в качестве компонента вакцинных препаратов [20].

На основании анализа литературных данных по иммуногенным белкам вируса осповакцины были выбраны гены вируса оспы овец штамма «НИСХИ» sppv095 и sppv141,являющиеся ортологами генов А4L и B5R, соответственно.

Для изучения антигенных и иммуногенных свойств выбранных белков необходимо было получить их в чистом виде. Для экспрессии генов, кодирующих целевые белки, мы использовали бактериальную систему E.coli штамм Т7. В результате индукции бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды pSPPV095 и pSPPV141ΔТМ, установлена экспрессия белков, молекулярный вес которых соответствовал расчетному для SPPV095 и SPPV141 19 и 22 кДа, соответственно (рисунок 1).Рекомбинантные белки формировали в клетках тельца-включения (рисунок 1, дорожки А5 и Б2).

А. pSPPV095: 1 – маркер молекулярного веса (SpectraMulticolorBroadRangeProteinLadder, ThermoScientific, Waltham, MA); 2 – клеточный лизат до индукции; 3 – после индукции ИПТГ; 4 – фракция растворимых белков; 5 – включения; Б. pSPPV141ΔТМ: 1 – маркер молекулярного веса; 2 – включения; 3 – фракция растворимого белка; 4 – клеточный лизат до индукции; 5 –после индукции ИПТГ
Рис. 1. Электрофоретический анализ белков клеточного лизата E.coli

А. pSPPV095: 1 – molecular weight marker (Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder, Thermo Scientific, Waltham, MA); 2 – cell lysate before induction; 3 – after induction with IPTG; 4 – soluble proteins; 5 – inclusion bodies; Б. pSPPV141ΔТМ: 1 – molecular weight marker; 2 – inclusion bodies; 3 – soluble proteins; 4 – cell lysate before induction; 5 – after induction with IPTG
Fig.1. Electrophoretic analysis of the E.coli cell lysate proteins
 
А. pSPPV095: 1 – маркер молекулярного веса (SpectraMulticolorBroadRangeProteinLadder, ThermoScientific, Waltham, MA); 2 – клеточный лизат до индукции; 3 – после индукции ИПТГ; 4 – фракция растворимых белков; 5 – включения; Б. pSPPV141ΔТМ: 1 – маркер молекулярного веса; 2 – включения; 3 – фракция растворимого белка; 4 – клеточный лизат до индукции; 5 –после индукции ИПТГ
Рис. 1. Электрофоретический анализ белков клеточного лизата E.coli

А. pSPPV095: 1 – molecular weight marker (Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder, Thermo Scientific, Waltham, MA); 2 – cell lysate before induction; 3 – after induction with IPTG; 4 – soluble proteins; 5 – inclusion bodies; Б. pSPPV141ΔТМ: 1 – molecular weight marker; 2 – inclusion bodies; 3 – soluble proteins; 4 – cell lysate before induction; 5 – after induction with IPTG
Fig.1. Electrophoretic analysis of the E.coli cell lysate proteins

 

Для детекциии очистки рекомбинантных белков аминокислотные последовательности были модифицированы путем добавления на С-конце шести остатков гистидина[11]. Анализ клеточных лизатов методом вестерн-блота с использованием анти-HIS мышиных иммуноглобулинов подтвердил наличие экспрессии генов, кодирующих рекомбинантные белки вируса оспы овец (рисунок 2). Как видно из рисунка 2, антитела связывались с белками, молекулярный вес которых соответствовал расчетному, что подтверждает также наличие гексагистидиновой метки в молекуле белка.

А – SPPV095; Б – SPPV141; 1 –до индукции; 2 – после индукции ИПТГ
Рис. 2. Иммуноблотинг рекомбинантных белков ВОО, экспрессированных в клетках E.coli , с использованием anti-His (Cterm)/AP антител

А– SPPV095; Б – SPPV141; 1 – before induction; 2 – after induction with IPTG
Fig.2. Immunoblotting of the SPPV recombinant proteins produced in E.coli using anti-His (Cterm)/AP antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA USA)
 
А – SPPV095; Б – SPPV141; 1 –до индукции; 2 – после индукции ИПТГ
Рис. 2. Иммуноблотинг рекомбинантных белков ВОО, экспрессированных в клетках E.coli , с использованием anti-His (Cterm)/AP антител

А– SPPV095; Б – SPPV141; 1 – before induction; 2 – after induction with IPTG
Fig.2. Immunoblotting of the SPPV recombinant proteins produced in E.coli using anti-His (Cterm)/AP antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA USA)

 

Экспрессия любого чужеродного гена зависит от его родства с организмом-хозяином. Многие представители как про- так и эукариотических организмов способны к экспрессии чужеродных генов. Для получения рекомбинантных белков с клонированной эукариотической ДНК обычно используют прокариотические системы экспрессии. Однако в некоторых случаях эукариотические белки, синтезированные в бактериях, оказываются нестабильными или биологически неактивными [21].

С целью определения антигенной активности полученных рекомбинантных белков следующим этапом было проведение исследования с использованием специфической сыворотки, полученной от овец, экспериментально инфицированных вирусом оспы овец (рисунок 3).

А – нормальная овечья сыворотка; В – сыворотка от овец, экспериментально инфицированных ВОО; М – маркер молекулярного веса (ThermoScientific, США); ВОО – вирус оспы овец; К – контроль, лизат клеток E. coli, трансформированных рЕТ 26 (b+)
Рис. 3.Иммуноблотинг рекомбинантных белков ВОО, экспрессированных в клетках E.coli

А – sera from healthy sheep; В – sera from the sheep experimentally infected with SPPV; М – molecular weight marker (Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder, Thermo Scientific, Waltham, MA); ВОО – sheep pox virus; К – control, cell lysate E. coli, transformed by рЕТ 26 (b+)
Fig. 3. Immunoblotting of the SPPV recombinant proteins produced in E.coli
 
А – нормальная овечья сыворотка; В – сыворотка от овец, экспериментально инфицированных ВОО; М – маркер молекулярного веса (ThermoScientific, США); ВОО – вирус оспы овец; К – контроль, лизат клеток E. coli, трансформированных рЕТ 26 (b+)
Рис. 3.Иммуноблотинг рекомбинантных белков ВОО, экспрессированных в клетках E.coli

А – sera from healthy sheep; В – sera from the sheep experimentally infected with SPPV; М – molecular weight marker (Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder, Thermo Scientific, Waltham, MA); ВОО – sheep pox virus; К – control, cell lysate E. coli, transformed by рЕТ 26 (b+)
Fig. 3. Immunoblotting of the SPPV recombinant proteins produced in E.coli

 

В результате было установлено, что целевые белки связывались со специфической сывороткой, что подтверждает наличие антигенной активности рекомбинантных белков вируса оспы овец, экспрессированных в бактериальной системе.

Несмотря на то, что гены экспрессировались в прокариотической системе, это никак не повлияло на антигенные свойства полученных рекомбинантных белков.

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии – подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким.

Никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует. Большинство таких генов имеют уникальные молекулярные свойства, и оптимальные условия экспрессии для каждого из них приходится подбирать всякий раз заново.

С целью оптимизации условий процесса биосинтеза целевого белка было исследовано влияние посевной концентрации ночной культуры E.coli/рЕТ, температуры выращивания и концентрации индуктора на уровень экспрессии рекомбинантных белков.

На первом этапе определяли оптимальную посевную концентрацию ночной культуры E.coli штамма Т7 на примере гена sppv095 (рисунок 4).

М –маркер молекулярного веса; 1, 11 – клеточный лизат до индукции; 30 минут после индукции ИПТГ: 2 – 1:20; 3 – 1:50; 4 – 1:100; 60 минут: 5 – 1:20; 6 – 1:50; 7 – 1:100; 90 минут: 8 – 1:20; 9 – 1:50; 10 – 1:100; 120 минут: 12 – 1:20; 13 – 1:50; 14 – 1:100; 150 минут: 15 – 1:20; 16 – 1:50; 17 – 1:100; 180 минут: 18 – 1:50; 19 – 1:100
Рис. 4. Электрофорез клеточных лизатов при определении оптимальной посевной концентрации и времени индукции

М– molecular weight marker; 1, 11 – cell lysate before induction; 30 min after IPTG-induction: 2 – 1:20; 3 – 1:50; 4 – 1:100; 60 min: 5 – 1:20; 6 – 1:50; 7 – 1:100; 90 min: 8 – 1:20; 9 – 1:50; 10 – 1:100; 120 min: 12 – 1:20; 13 – 1:50; 14 – 1:100; 150 min: 15 – 1:20; 16 – 1:50; 17 – 1:100; 180 min: 18 – 1:50; 19 – 1:100
Fig.4. Electrophoresis of cell lysates when determining the optimal concentration of seed and induction time
 
М –маркер молекулярного веса; 1, 11 – клеточный лизат до индукции; 30 минут после индукции ИПТГ: 2 – 1:20; 3 – 1:50; 4 – 1:100; 60 минут: 5 – 1:20; 6 – 1:50; 7 – 1:100; 90 минут: 8 – 1:20; 9 – 1:50; 10 – 1:100; 120 минут: 12 – 1:20; 13 – 1:50; 14 – 1:100; 150 минут: 15 – 1:20; 16 – 1:50; 17 – 1:100; 180 минут: 18 – 1:50; 19 – 1:100
Рис. 4. Электрофорез клеточных лизатов при определении оптимальной посевной концентрации и времени индукции

М– molecular weight marker; 1, 11 – cell lysate before induction; 30 min after IPTG-induction: 2 – 1:20; 3 – 1:50; 4 – 1:100; 60 min: 5 – 1:20; 6 – 1:50; 7 – 1:100; 90 min: 8 – 1:20; 9 – 1:50; 10 – 1:100; 120 min: 12 – 1:20; 13 – 1:50; 14 – 1:100; 150 min: 15 – 1:20; 16 – 1:50; 17 – 1:100; 180 min: 18 – 1:50; 19 – 1:100
Fig.4. Electrophoresis of cell lysates when determining the optimal concentration of seed and induction time

 

В результате проведенных исследовании установлено, что при посевной концентрации ночной культуры в соотношении 1:50 и времени выращивания после добавления индуктора 60 минут было выявлено наибольшее накопление целевого белка (рисунок 4, дорожка 6).

Далее были определены оптимальные условия индукции экспрессии генов, обеспечивающие высокий выход рекомбинантного белка. Уровень экспрессии белков оптимизирован по концентрации индуктора и температуре. В качестве индуктора использовали ИПТГ в концентрации 1мМ, 0,5мМ, 0,25мМ. Экспрессию проводили при температурах 37°С, 30°С, 25°С, 18°С в термостате, оснащенным шейкером роторного типа.

В результате было установлено, что максимальный уровень экспрессии гена sppv-095 в клетках E.coli наблюдается при использовании ИПТГ в конечной концентрации 0,5 мМ после 4-часовой ферментации при 37°С (рисунок 5А). Тогда как для гена sppv-141 высокий выход наблюдается при конечной концентрации ИПТГ 0,25 мМ после 4-часовой ферментации при 25°С (рисунок 5Б).

А. М – маркер молекулярного веса; Pre– клеточный лизат до индукции; 1 – 0,5 мМ ИПТГ, 37°С; 2 – 1 мМ ИПТГ, 37°С; 3 – 0,5 мМ ИПТГ, 30°С; 4 – 1 мМ ИПТГ, 30°С; 5 – 0,25 мМ ИПТГ, 25°С; 6 – 0,5 мМ ИПТГ, 18°С; 7 – 1 мМ ИПТГ, 25°С; 8 – 0,25 мМ ИПТГ, 18°С; 9 – 0,5 мМ ИПТГ, 25°С; 10 – 1 мМ ИПТГ, 18°С; Б. М – маркер молекулярного веса; 1 – 1 мМ ИПТГ, 37°С; 2 – 0,5 мМ ИПТГ, 37°С; 3 – 1 мМ ИПТГ, 30°С; 4 – 0,5 мМ ИПТГ, 30°С; 5 – 0,5 мМ ИПТГ, 25°С; 6 – 0,25 мМ ИПТГ, 25°С; 7 – 0,5 мМ ИПТГ, 18°С; 8 – 0,25 мМ ИПТГ, 18°С; 9 – 0,125 мМ ИПТГ, 18°С; 10 – клеточный лизат до индукции
Рис. 5.Иммуноблотинг рекомбинантных белков ВОО: определение оптимальной концентрации ИПТГ и температуры индукции

А. SPPV095: М – molecular weight marker; Pre– cell lysate before induction; 1 – 0,5 мМIPTG, 37°С; 2 – 1 мМIPTG, 37°С; 3 – 0,5 мМIPTG, 30°С; 4 – 1 мМIPTG, 30°С; 5 – 0,25 мМIPTG, 25°С; 6 – 0,5 мМIPTG, 18°С; 7– 1 мМIPTG, 25°С; 8 – 0,25 мМIPTG, 18°С; 9 – 0,5 мМIPTG, 25°С; 10 – 1 мМIPTG, 18°С; Б. SPPV141: М – molecular weight marker; 1 – 1 мМIPTG, 37°С; 2 – 0,5 мМIPTG, 37°С; 3 – 1 мМIPTG, 30°С; 4 – 0,5 мМIPTG, 30°С; 5 – 0,5 мМIPTG, 25°С; 6 – 0,25 мМIPTG, 25°С; 7 – 0,5 мМIPTG, 18°С; 8 – 0,25 мМIPTG, 18°С; 9 – 0,125 мМIPTG, 18°С; 10 – cell lysate before induction
Fig.5.Immunoblotting of recombinant proteins SPPV: determine the optimal concentration of IPTG and induction temperature
 
А. М – маркер молекулярного веса; Pre– клеточный лизат до индукции; 1 – 0,5 мМ ИПТГ, 37°С; 2 – 1 мМ ИПТГ, 37°С; 3 – 0,5 мМ ИПТГ, 30°С; 4 – 1 мМ ИПТГ, 30°С; 5 – 0,25 мМ ИПТГ, 25°С; 6 – 0,5 мМ ИПТГ, 18°С; 7 – 1 мМ ИПТГ, 25°С; 8 – 0,25 мМ ИПТГ, 18°С; 9 – 0,5 мМ ИПТГ, 25°С; 10 – 1 мМ ИПТГ, 18°С; Б. М – маркер молекулярного веса; 1 – 1 мМ ИПТГ, 37°С; 2 – 0,5 мМ ИПТГ, 37°С; 3 – 1 мМ ИПТГ, 30°С; 4 – 0,5 мМ ИПТГ, 30°С; 5 – 0,5 мМ ИПТГ, 25°С; 6 – 0,25 мМ ИПТГ, 25°С; 7 – 0,5 мМ ИПТГ, 18°С; 8 – 0,25 мМ ИПТГ, 18°С; 9 – 0,125 мМ ИПТГ, 18°С; 10 – клеточный лизат до индукции
Рис. 5.Иммуноблотинг рекомбинантных белков ВОО: определение оптимальной концентрации ИПТГ и температуры индукции

А. SPPV095: М – molecular weight marker; Pre– cell lysate before induction; 1 – 0,5 мМIPTG, 37°С; 2 – 1 мМIPTG, 37°С; 3 – 0,5 мМIPTG, 30°С; 4 – 1 мМIPTG, 30°С; 5 – 0,25 мМIPTG, 25°С; 6 – 0,5 мМIPTG, 18°С; 7– 1 мМIPTG, 25°С; 8 – 0,25 мМIPTG, 18°С; 9 – 0,5 мМIPTG, 25°С; 10 – 1 мМIPTG, 18°С; Б. SPPV141: М – molecular weight marker; 1 – 1 мМIPTG, 37°С; 2 – 0,5 мМIPTG, 37°С; 3 – 1 мМIPTG, 30°С; 4 – 0,5 мМIPTG, 30°С; 5 – 0,5 мМIPTG, 25°С; 6 – 0,25 мМIPTG, 25°С; 7 – 0,5 мМIPTG, 18°С; 8 – 0,25 мМIPTG, 18°С; 9 – 0,125 мМIPTG, 18°С; 10 – cell lysate before induction
Fig.5.Immunoblotting of recombinant proteins SPPV: determine the optimal concentration of IPTG and induction temperature

 

Следующим важным, как и сама экспрессия, этапом данной работы, является выделение и очистка полученных рекомбинантных белков.

На рисунке 6 представлены результаты очистки рекомбинантных белков SPPV095 (А) и SPPV141 (Б) вируса оспы овец.

М –маркер молекулярного веса; 1 – клеточный лизат до индукции; 2 – после индукции ИПТГ; 3 – надосадок клеточного лизата после обработки лизоцимом; 4 – фракция, прошедшая сквозь колонку сNi-NTAагарозой; 5 – осадок клеточного лизата после обработки лизоцимом; 6-16 – фракции очищенного белка
Рис. 6. Электрофоретический анализ рекомбинантных белков SPPV095 (А) и SPPV141 (Б) в процессе очистки
М– molecular weight marker; 1 – cell lysate before induction; 2 – after IPTG-induction; 3 – supernatant after adding lysozyme; 4 – fraction flow-through Ni-NTA-agarose column; 5 – pellet after adding lysozyme; 6-16 – purified protein fractions
Fig.6.Electrophoretic analysis of the SPPV095 (А) and SPPV141 (B) recombinant proteins purification
 
М –маркер молекулярного веса; 1 – клеточный лизат до индукции; 2 – после индукции ИПТГ; 3 – надосадок клеточного лизата после обработки лизоцимом; 4 – фракция, прошедшая сквозь колонку сNi-NTAагарозой; 5 – осадок клеточного лизата после обработки лизоцимом; 6-16 – фракции очищенного белка
Рис. 6. Электрофоретический анализ рекомбинантных белков SPPV095 (А) и SPPV141 (Б) в процессе очистки
М– molecular weight marker; 1 – cell lysate before induction; 2 – after IPTG-induction; 3 – supernatant after adding lysozyme; 4 – fraction flow-through Ni-NTA-agarose column; 5 – pellet after adding lysozyme; 6-16 – purified protein fractions
Fig.6.Electrophoretic analysis of the SPPV095 (А) and SPPV141 (B) recombinant proteins purification

 

Рекомбинантные белки формировали в бактериальных клетках тельца включений, в связи с чем на первом этапе очистки проводили разрушение клеток для получения фракции нерастворимых белков, как минимум 50% которой составлял целевой белок. Дополнительную очистку рекомбинантных белков проводили металло-аффинной хроматографией с использованием Ni-NTA агарозы. Как видно из электрофореграммы, целевые белки хорошо сорбировались на ионах Ni2+  и элюировались одним пиком 8М мочевиной. Во фракциях элюции были обнаружены целевые белки, свободные от примесей.

В данной работе целенаправленно из индуцированного клеточного лизата были получены тельца включения, что позволило выделить белки с очень высокой степенью очистки (примерно 98% по данным электрофоретического анализа в ДСН-ПААГ). Выход целевого продукта составил 7-10 мг из 1 л культуры клеток E.coli. Исследования в этом направлении продолжаются. В дальнейшем будут исследованы иммунологические свойства белков по способности стимулировать выработку вирус нейтрализующих антител на лабораторных и целевых животных.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом,проведена экспрессия целевых белков, оценка их подлинности методом вестерн-блота со специфическими сыворотками, а также оптимизация уровня экспрессии целевых белков вируса оспы овец.

В результате индукции бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды pSPPV095 и pSPPV141ΔТМ, были получены белки SPPV095 и SPPV141 с молекулярными массами 19 и 22 кДа, соответственно.

Рекомбинантные белки взаимодействовали как с anti-His (Cterm)/AP антителами, так и с анти-ВОО сывороткой, что свидетельствует о специфичности и сохранении антигенной активности при экспрессии в прокариотической системе.

В процессе оптимизации были определены условия культивирования штаммов-продуцентов, обеспечивающие максимальный уровень экспрессии генов вируса оспы овец: sppv-095– 0,5 мМ ИПТГ при 37°C, sppv-141 – 0,25 мМ ИПТГ при 25°C. Выход целевых белков составил 7-10 мг с 1 л бактериальной культуры.

Полученные рекомбинантные белки после определения их иммуногенных характеристик будут использованы для разработки средств специфической профилактики оспы овец.

 

Финансирование

Исследования выполнены при поддержке Министерства образования и науки Республики Казахстан в рамках проекта 1292/ГФ4 «Рекомбинантная вакцина для профилактики оспы овец» на 2015-2017 гг. (№ГР0115РК01983).

 

REFERENCES

 

  1. Sjurin V.N., Samujlenko A.Ja., Solov'ev B.F. i dr. Вирусные болезни животных [Viral diseases of animals]. M., VNITIBP, 1998, pp.128-134.
  2. Levefre P.C. Sheep and goats pox. Ins. Elev.Med.Vet.: Pays trop. Prod.,1983,p.171.
  3. Bakulov I.A., Vlasova T.A., Ternovaja S.F.i dr. Особо опасные болезни животных: Справочник [Particularly dangerous animal diseases]. Pokrov, VNIIVViM, 2002, p. 159.
  4. World Animal Health. Reports on the animal Health Status and Disease Control Methods and List a Disease Outbreaks. Paris, Statistics O.I.E., 1996, p. 4.
  5. Ivanjushhenkov V.N., Kekuh V.T., Koreba O.A. Реактогенныесвойствавирусвакциныпротивоспыовец [Reactogenicity properties virusvaktsiny against sheep pox]. Veterinary Journal, 1990, no. 7, pp. 28-30.
  6. Shhelkunov S.N. Вакцины на основе вирусных антигенов. Противовирусные вакцины: от дженнера до наших дней. Биология [Vaccines based on virus antigens. Antiviral vaccines from Jenner to the present day. Biology]. SorosEducationalJournal,1998, no. 8, pp. 43-50.CROSSREF.
  7. Moss B., Knipe D.M., etc. Poxviridae and their replication. Fields virology, 2nd ed. Raven press. NY, 1990, p. 120.
  8. Kurchenko F.P., Ivanjushhenkov V.N., Ufimcev K.P. i dr. Эффективность сухой культуральной вакцины из штамма НИСХИ против оспы овец [The effectiveness of a dry culture of a vaccine against a strain of sheep pox].Veterinary Journal,1991, no. 10, pp.21-23.
  9. Jadhav K.M., Pandey A.K., Radadia N.S. Field observations on sheep pox tissue culture vaccine. Indian Vet. J., 1989, vol. 66, pp. 908-912.
  10. Glik B., Pasternak Dzh. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение [Molecular Biotechnology. Principles and Applications]. M., Mir, 2002, pp. 228-229.
  11. Tajlakova Je.T., Azhibaeva D.T., Chervjakova O.V. i dr.Создание генетических конструкции для экспрессии рекомбинантных белков А4L и B5R вируса оспы овец [Creation of genetic constructs for the expression of recombinant proteins A4L and B5R sheep pox virus]. Recent biological safety problems and prospects: Coll. articles of scientific-practical conference. Gvardeiskiy, 2012, pp. 174-179.
  12. BugBuster® Protein Extraction Reagent //http://search.cosmobio.co.jp/cosmo_ search_p/search_gate2/docs/NVG_/714563.20051122.pdf
  13. Ni-NTA Purification System for purification of polyhistidine-containing recombinant proteins //https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/ninta_ system man.pdf.
  14. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, pp.680-685.PubMed.
  15. Vannovskij T.Ja.Оспа коз и ее специфическая профилактика: автореф. …докт.вет. наук [Smallpox goats and its specific prevention: the author's abstract of the dissert. of the doct. of veter. sciences].Voronezh, 1966,p. 342.
  16. Breiman A., Smith G.L. The vaccinia virus B5 protein affects the glycosylation, localisation and stability of the A34 protein.J Gen Virol., 2010, vol. 91, pp.1823-27.PubMed.
  17. Berhanu A., Wilson R.L., Kirkwood D.L -Watts et. al. Vaccination of BALB/c mice with Escherichia coli-expressed vaccinia virus proteins A27L, B5R, and D8L protects mice from lethal vaccinia virus challenge.J. Virol.,2008, vol. 82, pp.3517-3529.PubMed.
  18. Bell E., ShamimА.M., Whitbeck J.C.et. al. Antibodies against the extracellular enveloped virus B5R protein are mainly responsible for the EEV neutralizing capacity of vaccinia immune globulin. Virology, 2004, vol. 325, pp. 425-431.CROSSREF.
  19. Roos N., Cyrklaff M., Cudmore S.et. al. The use of a novel immunogoldcryoelectron microscopic method to investigate the structure of the intracellular and xtracellular forms of vaccinia virus. EMBO J., 1996, vol. 151, pp. 2343-2355.PubMed.
  20. Yadav M.P., Pandey A.B., Negi B.S. et al. Studies on an inactivated goat pox vaccine. Indian J. Virol., 1986, vol. 2, pp. 202-221.CROSSREF.
  21. Glik B., Pasternak Dzh. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение [Molecular Biotechnology. Principles and Applications]. M., Mir, 2002, p. 131.

 

ЗАМАНАУИ ТЕЛІМДІ АЛДЫН АЛУ ҚҰРАЛЫН ЖАСАҚТАУ ҮШІН ҚОЛДАНУҒА БОЛАТЫН SPPV095 ЖӘНЕ SPPV141 БЕЛОКТАРДЫ КОДТАЙТЫН ҚОЙ ШЕШЕГІ ВИРУСЫ ГЕНДЕРІНІҢ БАКТЕРИАЛДЫ ЭКСПРЕССИЯСЫ

 

Тайлақова Э.Т., Червякова О.В.
Биологиялық қауіпсіздік проблемаларынның ғылыми-зерттеу институты
құк. Гвардейский, Қордай ауданы, Жамбыл облысы, 080409, Қазақстан

This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ТҮЙІН

Екпе егу жұқпалы аурулардың жан жақа тарауын ескертетін тиімді құралдардың бірі болып саналады. Сондықтан қазіргі таңда қолданыста бар ауруларды алдын алу препараттарын толық жетілдіру өзекті мәселелердің бірі. Соңғы кездері ауруларды алдын алу препараттарын жасақтау барысында антигенді және иммуногенді қасиеттерге ие рекомбинантты белоктар қолданылып жатыр. Соңғы жылдары республикада тарауы жиі тіркеліп жатқан жәнеде мал шаруашылығының дамуына қатер туғызып жатқан, қой шешегіне қарсы суббірлік вакцинаны жасақтау үшін қой шешегі вирусының рекомбинантты белоктарын жасау осы жұмыстың мақсаты болып табылады. Жүргізілген зерттеулер нәтижесінде қой шешегі вирусының sppv-095 және sppv-141 гендерінің экспрессияларын бактериалды жүйеде оңтайландыру жағдайлары анықталынды. Нәтижесінде рекомбинантты белоктардың жоғарғы шекті мөлшерлері sppv-095 гені үшін штамм-продуцентті ИПТГ 0,5 мМ ақырғы концентрациясында индуцирлеп, 37°С температурасында ал, sppv-141 гені үшін ИПТГ 0,25 мМ ақырғы концентрациясында индуцирлеп, 25°С температурасында 4 сағат бойы инкубациялау арқылы алынды.

Рекомбинантты белоктардың экспрессиясы полигистидинге арналған сыворотканы қолдана отырып иммуноблоттинг әдісі арқылы расталынды. Қой шешегі вирусына алынған антиденелермен рекомбинантты белоктар серологиялық реакцияларда өзара әрекеттесті. Бұл жағдай рекомбинантты белоктардың прокариот жүйесінде экспрессиясы кезінде телімді антигенді белсенділіктері сақталынып қалғанын айқындайды.

Жасап алынған рекомбинантты белоктарды ауруды алдын алуға арналған препараттарды жасақтау барысында қолданылатын болады.

Негізгi сөздер: рекомбинантты белок, клонирлеу, экспрессия, индукция, қой шешегі вирусы.