1/2017
IssabekovaA.S.1, ZhunusovaM.S.2, RamanculovE.M.1, KulyyassovA.T.1
1Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» under the Science Committee of Ministry of Education and Science of the Republic of Kazakhstan,
Astana, 010000, 13/5, Kurgalzhynskoye road,
2L.N.Gumilyov Eurasian National University,
5, Munaitpasov str.,010000, Astana, Kazakhstan
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ABSTRACT

The expression of transgenes and control of gene expression in mammalian cells is an active area of biomedical research. Therefore, the improvement of methods for effective gene transfer into eukaryotic cells is of great interest and remains are search priority. We compared different methods of transient transfection of HEK293T cells, namely calcium phosphate with different pH values of the HBS buffer solution,6.90, 6.95, 7.00, 7.05 and 7.10, as well ascommercial sets of FuGENE and Lipofectamine. Results were analyzed using fluorescence microscopy with green fluorescent protein GFP as a reporter gene. We determined that the optimal pH of the HBS phosphate buffer for transient transfection was 6.95. A small pH deviation in the range of 6.90–7.10 did not significantly modify the expression efficiency of a protein of interest. Among the methods studied, Lipofectamine showed the highest level of transfection efficiency based on expression of the GFP protein, but exceeding the recommended dose of this reagent exerted a toxic effect on the viability of HEK293T cells.

Keywords: Plasmid, DNA, transient transfection, HEK293T

 

576.53:57.085.23:57.085.25:577.218

СРАВНЕНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ТРАНЗИЕНТНОЙ ТРАНСФЕКЦИИ НА КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ HEK293T

 

ИсабековаА.С.1, ЖунусоваМ.С.2, РаманкуловЕ.М.1, КулыясовА.Т.1
1РГП «Национальный центр биотехнологии», КН МОН,
Кургальджинское шоссе, 13/5, Астана, 010000,Казахстан
2Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева,
ул. Мунайтпасова, 5, Астана, 010000, Казахстан
akulyyasov@gmail.com

 

АБСТРАКТ

Экспрессия трансгенов и контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих является основой биомедицинских исследований. Следовательно, улучшение методов эффективного переноса генов внутрь эукариотических клеток представляет большой интерес и остается одним из приоритетных направлений исследований.

Нами проведено сравнение различных методов транзиентнойтрансфекции клеток HEK293T, а именно кальций фосфатной с различными значениямиpH буферного раствора HBS – 6,90, 6,95, 7,00, 7,05 и 7,10, а также с помощью коммерческих наборов FuGENE и Lipofectamine. Полученные результаты проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием зеленого флуоресцирующего белка GFP, как репортерного гена.

По результатам проведенных экспериментов установлено, что оптимальным значением фосфатного буфера HBS для проведения транзиентнойтрансфекции является величина pH 6,95. Кроме того, небольшое отклонение рН в диапазоне 6,90-7,10 заметно не влияет на эффективность экспрессии интересующего нас белка.

Ключевые слова: плазмиды, ДНК, транзиентнаятрансфекция, клеточные линии, HEK293T.


ВВЕДЕНИЕ

Трансфе́кция–процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки эукариот без участия вирусов, является мощным аналитическим методом, позволяющим изучить функции генов и их продуктов внутри клетки [1]. Обычно для решения поставленной задачи ДНК вводят в клетки лишь на какое-то время, достаточное для её экспрессии. Т.к. трансфицированная ДНК обычно не включается в ядерный геном и не реплицируется, чужеродная ДНК быстро теряется по мере размножения клеток. Такой способтрансфекции называется транзиентным. Этот метод широко используется не только в фундаментальных исследованиях, но также имеет большой потенциал для практического применения в биофармацевтической промышленности для производства рекомбинантных белков в культурах клеток для нужд медицины [2]. О возрастающем интересе исследователей и специалистов-технологов к данному методу отмечено в ряде обзорных статей [3-8].

Метод транзиентнойтрансфекции берет начало с пионерских работ Грэхема и Ван дер Эба, предложивших использовать комплексы ДНК с фосфатом кальция [9]. Различные вариантыкальций-фосфатнойтрансфекции до сих пор широко используются в лабораториях по всему миру, а также являются основой коммерческих наборов для экспрессии генов [10-11]. Основным преимуществом этой методики является дешевизна и доступность реагентов, простота приготовления буферных растворов в сочетании с довольно высокой эффективностью.

В общих чертах, для самостоятельного приготовления комплекса раствор, содержащий ДНК и хлорид кальция, медленно по каплям добавляют к раствору, содержащему фосфат ионы в буфере HEPES. Через некоторое время образуется осадок фосфата кальция со связанной на поверхности ДНК. После этого полученную суспензию добавляют к клеткам.Экспрессию белков в достаточном количестве обычно наблюдают через 48 часов. На эффективность трансфекции влияют множество параметров, как например, концентрации хлорида кальция и фосфатного буферного раствора, тип используемых клеток, рН, качество и количество ДНК, температура, концентрация сыворотки в среде, содержание СО2. Наиболее детальное изучение влияния различных факторов на эффективность трансфекции линии клеток CHO(Chinesehamsterovary) приведено в работе Джордана и Вурма [12]. В другой статье предлагается видоизмененная методика трансфекции клеток HeLa с применением инкубирования раствора комплексов ДНК с фосфатом кальция при 37°С в течение 30 минут, позволяющая увеличивать его эффективность [13].

Наиболее важным фактором, влияющим на качество трансфекции, является величина pH фосфатного буфера, который должен точно соответствовать рекомендуемым значениям [14]. Однако в литературе существуют небольшие расхождения относительно этой величины. Например, в работе Чена и др. [15] описана методика простой и эффективной кальций-фосфатнойтрансфекции линий клеток NIH3T3, C127, BHK, CHO, HeLa. Важным фактором эффективности процесса, согласно авторам этой работы, является величина pH (6.95) фосфатного буфера и уровень СО2 (3%) в течение инкубации клеток с ДНК.Согласно авторам другой работы [16], которые проводилитрансфекцию клеток CHO и HEK293,оптимальным является использование фосфатного буфера с pH (7.05).

Помимо кальций-фосфатного метода трансфекции, существуют также другие способы доставки ДНК в клетку, как например, использование липосом в наборе Lipofectamine[17] или мультикомпонентного реагента FuGENE [18], которые имеют более высокую эффективность. Однако эти реагенты являются дорогостоящими и при превышении определенной дозы обладают токсичностью по отношению к клеткам.

В литературе имеется статья, где проводили сравнение эффективности трансфекции линий астроцитомных клеток 1321N1 с помощью фосфата кальция, липофектамина и набора FuGENE [19].

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вектор, не содержащий эндотоксины (pcDNA3.1(+).BirA.GFP),получен согласно стандартным методикам [20] и наработан с помощью наборов для выделения плазмидной ДНК (Sigma, PLED35-1KT или Qiagen, 12362), согласно протоколам,приведенным в инструкциях или на сайтах компаний-производителей.В экспериментах использовали ранее полученную конструкциюpcDNA3.1(+).BirA.GFP [21-26].

Для проведения трансфекции использовали также наборы FuGENEHDTransfectionReagent (Promega, E2311) иLipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019).

Для приготовления среды в бутыль, содержащую 500 мл DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/мл, добавили 50 мл (10%) эмбриональной телячьей сыворотки (FetalBovineSerum, FBS) и 5 мл (1%) смеси антибиотиков стрептомицина и ампициллина (PS). Сыворотку нагревали 15 мин при 55°С и хранили при +4°C.

Экспрессию рекомбинантного белка из плазмидыpcDNA3.1(+).BirA.GFP осуществляли в клетках HEK293T (Humanembryonickidneycells линия 293Т).

Для приготовления клеток пробирку с НЕК293Т из Дьюара быстро разморозили при 37°C, затем центрифугировали при 200 rcf 3 минуты и удалили супернатант (удаление ДМСО). Используя пипетку на 5 мл,ресуспендировали 1 мл клеток в среде DMEM. Перенесли суспензию с клетками во флакон Т75, добавили дополнительно среды DMEM до объема 20 мл и поместили в инкубатор на 37°C (СО2–4,8%).

Наблюдение за клетками и сбор данных экспериментов осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа «AxioObserverA1» («CarlZeiss», Germany) со встроенной ССD-камерой «AxiocamErc5s» («CarlZeiss») и программного обеспечения Zen 2011. Обработку полученных снимков проводили с помощью программы «ImageJ».

 

Транзиентнаятрансфекция клеток HEK293T с помощью кальций-фосфатного метода

Для приготовления буферного раствора HBS 2x взяли компоненты в следующих количествах: Hepes 2 г, KCl0,15 г, глюкоза 0,4 г, NaCl 3,2 г, Na2HPO4 0,0426 г, pH должно составить 5,9. Затем растворразделили на пять пробирок в равных объемах и довели pH до необходимого значения в каждой (6,90, 6,95, 7,00, 7,05 и 7,10) добавлением небольшими порциями 1M раствора NaOH, отфильтровали через стерильный фильтр фирмы Millipore и хранили при 4°C.

За 1 день до трансфекции посеяли 200,000 клеток HEK293T в каждую лунку 6-луночной планшеты в 2 мл среды DMEM с 10% FBS и 1% PS. На следующий день за 1 час до трансфекции поменяли среду на 2 мл свежей DMEM. Затем в расчете на 1 лунку приготовили по две пробирки на 1.5 мл, промаркированные 0А, 0В (1А, 1В). Образец, помеченный меткой «0», содержащий хлорид кальция, без добавления ДНК взяли в качестве контроля. В одну пробирку (раствор А) загрузили 220 мкл воды, 31 мкл 2М раствора хлорида кальция и необходимое количество ДНК. Плазмиды брали в количестве 1.0 мкг на 1 лунку планшеты. Во вторую пробирку (раствор B) загрузили 250 мкл буферного раствора HBS 2x. Затем медленно по каплям добавляли раствор А к раствору В, оставили на 15 минут и добавили полученную смесь к клеткам HEK293T.

 

Транзиентнаятрансфекция клеток HEK293T с помощью реагента FuGENE

Перед приготовлением комплекса реагентаFuGENE с ДНКфлакон из набора переворачивали несколько раз для перемешивания его содержимого. В пробирку с 100 мклдеионизированной и стерильной воды добавили раствор плазмиды, содержащей 1,0 мкг ДНК.К раствору ДНК прибавили 5 мкл реагента FuGENE, непосредственно в среду, не касаясь пластиковых стенок пробирки. Перемешали полученную смесь переворачиванием или щелчком пальцем и оставили на 30 минут при комнатной температуре. После этого полученный комплекс добавили по каплям в лунку с клетками НЕК293Т.

 

Трансфекция с помощью набора Lipofectamine 2000

Для трансфекции предварительно смешивали 125 мкл Opti-MEMc 15 мклLipofectamine 2000 Reagent. В отдельной пробирке смешивали 125 мкл Opti-MEM с 5 мкл (1,0 мкг) ДНК. Добавляли готовую, разбавленную ДНК к разбавленномуLipofectamine 2000 Reagent. Инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавляли по каплям 250 мклДНК-липидный комплекс к клеткам в 6-луночном планшете. Инкубировали при 37°С в СО2 инкубаторе 48 часов.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Критически важным параметром, влияющим на качество трансфекции, является величина pH буферного раствора HBS (Hepes-bufferedsaline), который точно должен соответствовать рекомендуемому значению. И поскольку в литературе имеются некоторые отличия в рекомендуемых показателях кислотности HBS, мы приготовили несколько буферных растворов с различными значениями pH – 6,90, 6,95, 7,00, 7,05 и 7,10. Полученные растворы использовали в дальнейшем для экспрессии GFP-содержащего белка с использованием плазмидыpcDNA3.1(+).BirA.GFP, в структуре которого имеется сильный CMV промотор (рис. 1). Для сравнения, параллельно провели трансфекцию клеток с помощью коммерческих наборов FuGENE и Lipofectamine. В качестве отрицательного контроля использовали раствор фосфата кальция без добавления плазмиды(рис. 2).

Рис. 1.Дизайн вектора для трансфекции в эукариотических клетках на примере конструкции, содержащей ген GFP, слитый с BirA. (Конструкция получена на основе стандартной плазмидыpcDNA3.1(+) с CMV промотором)
Fig. 1.Design of vector for transfection in eukaryotic cells on example of vector, containing GFP gene, fused with BirA. (Construct was obtained on the basis of plasmid pcDNA3.1(+) with CMV promoter)
 
Рис. 1.Дизайн вектора для трансфекции в эукариотических клетках на примере конструкции, содержащей ген GFP, слитый с BirA. (Конструкция получена на основе стандартной плазмидыpcDNA3.1(+) с CMV промотором)
Fig. 1.Design of vector for transfection in eukaryotic cells on example of vector, containing GFP gene, fused with BirA. (Construct was obtained on the basis of plasmid pcDNA3.1(+) with CMV promoter)

 

А – контроль; Б – трансфекция с СаСl2 при pH 6,95; B – трансфекция с FuGENE; Г – трансфекция с липофектамином. Увеличение – 100Х
Рис. 2. Сравнение эффективности различных способов трансфекции
A – Control; Б – transfectionbyCaCl2 atpH 6,95; B – transfectionbyFuGENE; Г – transfectionbyLipofectamine. Zoom – 100X
Fig. 2.Comparison of efficiency of different transfection methods
 
А – контроль; Б – трансфекция с СаСl2 при pH 6,95; B – трансфекция с FuGENE; Г – трансфекция с липофектамином. Увеличение – 100Х
Рис. 2. Сравнение эффективности различных способов трансфекции
A – Control; Б – transfectionbyCaCl2 atpH 6,95; B – transfectionbyFuGENE; Г – transfectionbyLipofectamine. Zoom – 100X
Fig. 2.Comparison of efficiency of different transfection methods

 

ВовсехэкспериментахиспользовалиодинаковоеколичествоДНК (1.0 мкг). Оценку эффективности трансфекции проводили на флуоресцентном микроскопе с длиной возбуждения 499 нм в сравнении с нетрансфицированными клетками с использованием программы ImageJ для подсчета клеток. Результаты, приведенные в таблице 1, указывают, что значение pH 6,95 является наиболее оптимальным для клеток НЕК293Т. Хотя следует отметить, что и другие значения рН фосфатного буфера HBS также показывают сравнимую эффективность трансфекции.

Несмотря на то, что Lipofectamine показал максимальную эффективность экспрессии белка GFP(38,48±5,32, табл. 1), но его использование привело к снижению жизнеспособности клеток. Например, небольшое увеличение дозы этого реагента (15 мкл), привело к уменьшению числа клеток практически вдвое (рис.3), что сопоставимо с результатами аналогичных экспериментов на линии астроцитомных клеток 1321N1 [19].

 

Таблица 1. Сравнение эффективности транзиентнойтрансфекции различными методами
Table 1.Comparison of the effectiveness of transient transfection withdifferentmethods

Вид трансфекции

Type of transfection

Число клеток

Number of cells

Трансфицированные клетки

Transfected cells

% трансфицированных клеток

% of transfected cells

CaCl2(pH 6,90)

423±59

124±11

29,39±6,87

CaCl2(pH 6,95)

405±22

135±22

33,4±3,50

CaCl2(pH 7,00)

532±24

155±7

29,18±0,37

CaCl2(pH 7,05)

552±19

157±12

28,49±3,01

CaCl2(pH 7,10)

520±47

141±5

27,38±3,15

FuGENE

548±23

112±14

20,39±1,65

Lipofectamine

459±38

176±26

38,48±5,32

 

Рис. 3. Токсический эффект липофектамина на клеткиHEK293Т. Увеличение 50Х
Fig. 3.Toxic effect of Lipofectamine on HEK293T cells. Zoom 50X
 
Рис. 3. Токсический эффект липофектамина на клеткиHEK293Т. Увеличение 50Х
Fig. 3.Toxic effect of Lipofectamine on HEK293T cells. Zoom 50X

 

Таким образом, по результатам проведенных экспериментов установлено, что оптимальным значением фосфатного буфера HBS для проведения транзиентнойтрансфекции является величина pH 6,95. Небольшое отклонение рН этого буфера в диапазоне 6,90-7,10 заметно не влияет на эффективность экспрессии интересующего нас белка.

 

ВЫВОДЫ

Трансфекция клеток является сложным процессом, включающим несколько этапов, которые невозможно полностью контролировать. В то время как многие параметры процесса известны, не представляется возможным его полное понимание на молекулярном уровне. Однако строгое следование инструкциям и протоколам обычно приводит к эффективнойтрансфекции клеточных линий.

Кальций-фосфатную методику часто сравнивают с другими доступными методами трансфекции. Несмотря на растущий выбор новых коммерческих наборов и различных реагентов,данный метод все еще остается привлекательным. Это единственный способ, где присутствуют неорганические ионы, являющиеся естественными компонентами питательной среды, и, следовательно, в среде после проведения трансфекции отсутствуют синтетические химические вещества, которые могут снизить жизнеспособность клеток. Таким образом, спустя более 40 лет после опубликования,кальций-фосфатнаятрансфекция все еще остается полезным методом и широко применяется в лабораторной практике.

 

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Республики Казахстан в рамках проекта 1804/ГФ4 «Новые подходы для изучения и количественного анализа убиквитинированияinvivo, на основе метода биотинилирования от сближения» на 2015-2017 гг. (номер госрегистрации 0115РК01802).

 

REFERENCES

 

  1. Kim T.K., Eberwine J.H. Mammalian cell transfection: the present and the future.Anal. Bioanal. Chem., 2010,vol. 397, no. 8, pp. 3173-3178.
    CrossRef
  2. Ding K., Han L., Zong H., Chen J., Zhang B., Zhu J. Production process reproducibility and product quality consistency of transient gene expression in HEK293 cells with anti-PD1 antibody as the model protein.Appl. Microbiol. Biotechnol.,2017, vol. 101, no. 5, pp. 1889-1898.
    CrossRef
  3. Hacker D.L., Kiseljak D., Rajendra Y., Thurnheer S., Baldi L., Wurm F.M. Polyethyleneimine-based transient gene expression processes for suspension-adapted HEK-293E and CHO-DG44 cells.Protein Expr. Purif., 2013, no. 92, рр. 67-76.
    CrossRef
  4. Wurm F.M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.Nat. Biotechnol.,2004, vol. 22, no. 11, рр.1393-1398.
    CrossRef
  5. Geisse S. Reflections on more than 10 years of TGE approaches.Protein Expr. Purif. 2009, vol.64, no. 2, рр. 99-107.
    CrossRef
  6. Nettleship J.E., Assenberg R., Diprose J.M., Rahman-Huq N., Owens R.J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol., 2010, vol.172, no. 1, рр. 55-65.
    CrossRef
  7. Andrell J., Tate C.G. Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.J. Mol. Membr. Biol., 2013,vol.30, рр.52-63.
    CrossRef
  8. Bieniossek C., Imasaki T., Takagi Y., Berger I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.Trends Biochem. Sci., 2012,vol.37, no. 2, рр.49-57.
    CrossRef
  9. Graham F.L., Van der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.Virology,1973,vol.52, no. 2, рр.456-467.
    CrossRef
  10. www.thermofisher.com
    link
  11. www.sigmaaldrich.com
    link
  12. Jordan M.,Wurm F. M. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods,2004,vol.33, no. 2, рр.136-143.
    CrossRef
  13. Chowdhury E.H., Sasagawa T., Nagaoka M., Kundu A.K., Akaike T. Transfecting mammalian cells by DNA/calcium phosphate precipitates: Effect of temperature and pH on precipitation.Anal. Biochem.,2003,vol.314, no. 2, рр.316-318.
    CrossRef
  14. Higgins S.J., Hames B.D. Protein Expression. A practical approach. Oxford University Press, 1999, 282p.
  15. Chen C., Okayama H. High-Efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.Mol. Cell. Biology, 1987, vol.7, no. 8, рр.2745-2752.
    PubMed PMCID
  16. Jordan M., Schallhorn A. Wurm F.M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research.,1996,vol. 24, no. 4, рр. 596-601.
    PubMed PMCID
  17. Felgner P.L., Gadek T.R., Holm M.et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84, no. 21, pp. 7413-7417.
    CrossRef.
  18. Jacobsen L.B., Calvin S.A., Colvin K.E., Wright M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power.Methods, 2004,vol.33, no. 2,pp. 104-112.
    CrossRef
  19. Marucci G., Lammi C., Buccioni M.et al. Comparison and optimization of transient transfection methods at human astrocytoma cell line 1321N1.Anal Biochem.,2011, vol.414, no. 2, pp. 300-302.
    CrossRef
  20. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,480 p.
  21. Kulyyassov A., Shoaib M., Ogryzko V. Use of in vivo biotinylation for chromatin immunoprecipitation.Curr. Protoc. Cell Biol.,2011, chapter 17, unit17.12,pp. 17.12.1-17.12.22.
    CrossRef
  22. Kulyyassov A., Shoaib M., Pichugin A.et al. PUB-MS: a mass spectrometry-based method to monitor protein-protein proximity in vivo.J. Proteome Res., 2011, vol. 10, no. 10, pp. 4416-4427.
    CrossRef
  23. Shoaib M., Kulyyassov A., Robin C.et al. PUB-NChIP – “in vivo biotinylation” approach to studychromatin in proximity to a protein of interest. GenomeResearch, 2013, vol. 23, no. 2, pp. 331-340.
    CrossRef
  24. Kulyyassov A.T., Zhubanova G.S., Ramankulov E.M., Ogryzko V.V. Method of quantitative evaluation of heterochromatin protein HP1 interactions in vivo. Biotechnology. Theory and practice, 2014, no. 1, pp. 17-27.
  25. Patent of the Republic of Kazakhstan for invention, registration number 2013 / 1352.1. Number 30034, Bulletin # 6. The recombinant plasmid pcDNA3.1 (+) -BAP-HP1a, encoding the human heterochromatin protein HP1a, and providing its expression in HEK293T cells /Kulyyassov A.T., Ogryzko V.V. 16.10.2013, 6p.
  26. Patent of the Republic of Kazakhstan for invention, registration number 2013 / 1377.1. Number 30035, Bulletin # 6. The recombinant plasmid pcDNA3.1 (+) -BAP-KAP1, which encodes the human transcription cofactor protein KAP1, and providing its expression in HEK293T cells /Kulyyassov A.T., Ogryzko V.V. 16.10.2013, 6p.

 

HEK293T ЖАСУША ЛИНИЯСЫНДА ТРАНЗИЕНТТІ ТРАНСФЕКЦИЯ ӘДІСІН САЛЫСТЫРУ ЖӘНЕ ОПТИМИЗАЦИЯЛАУ

 

А.С. Исабекова1, М.С. Жунусова2, Е.М. Раманқулов1, А.Т.Құлыясов1
1 РМК «Ұлттық биотехнология орталығы», Қазақстан Республикасының Білім және ғылым министірлігің Ғылым комитеті, Қорғалжын тас жолы 13/5, Астана қ., 010000, Қазақстан
2 Л.Н. Гумилев атындағы Евразия ұлттық университеті, Мунайтпасов көшесі, 5, Астана қ., 010000, Қазақстан
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

ТҮЙІН

Трансгендердің экспрессиясы және сүтқоректілер жасушаларында гендер экспрессиясын бақылауда ұстау биомедициналық зерттеулердің негізі болып табылады.  Яғни, эукариоттық жасушаның ішіне гендерді тиімді көшіру әдісін жетілдіру үлкен қызығушылық тудырады және зерттеудің басым бағыты болып табылады.

Біз HEK293T жасушаларына әртүрлі транзиентті трансфекция әдістерін салыстыру жүргіздік, оның ішінде әртүрлі pH-пен HBS буферлі ерітіндісі  – 6.90, 6,95, 7,00, 7,05 және 7,10 негізіндегі кальций фосфатты, сонымен қатар FuGENE мен Lipofectamine коммерциялық жинақтары арқылы. Алынған нәтижелер репортер ген негізіндегі жасыл флуоресцентті ақуыз GFP көмегімен флуоресцентті микроскопия арқылы алынды.

Жүргізілген тәжірибелер нәтижелері бойынша транзиентті трансфекция жүргізу үшін HBS фосфатты буферінің ең қолайлы pH мәні 6,95 болып табылады.   Сонымен қатар pH  6,90 – 7,10 диапозонында сәл ауытқуы бізді қызықтыратын ақуыздардың экспрессиясына айтарлықтай әсер етпейді. Зерттелген әдістердің ішінде GFP белогының экспрессиясы бойынша Lipofectamine ең жоғарғы трансфекция нәтижелілігінің деңгейін көрсеткеніне қарамастан бұл реагенттің ұсынылған мөлшерінен жоғарылату HEK293T жасушаларына айқын улы әсер көрсетті.

Негізгі сөздер: Плазмидалар, ДНҚ, транзиентті трансфекция, жасуша линиясы, HEK293T.