1/2014

 

МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ГЕТЕРОХРОМАТИНОВОГО БЕЛКА HP1 IN VIVO


А.Т. Кулыясов1, Г.С. Жубанова1, Е.М. Раманкулов1, В.В. Огрызько2
1 Национальный центр биотехнологии, Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан, ул. Ш. Валиханова, 13/1, г. Астана, 010000, Казахстан
Institut Gustave Roussy, CNRS UMR8126, 94805, Villejuif, France, 39 Rue Camilles Desmoulin
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

АБСТРАКТ

Развитие и прогрессирование рака связано с изменениями в экспрессии генов, которые могут быть следствием генетических и эпигенетических отклонений, и, следовательно, белки НР1α, β и γ являются потенциальными онкомаркерами. Наряду с определением уровня экспрессии этих онкомаркеров, большой интерес представляет анализ их интерактóм и белок-белковых взаимодействий.
Разработанный нами метод, названный Proximity Utilizing Biotinylation (PUB) или биотинилирование от сближения (взаимодействия) белков in vivo, основан на коэкспрессии внутри одной клетки рекомбинантных белков - интересующего белка с биотин лигазой BirA и его партнера с пептидом акцептором биотина BAP, что позволяет провести точную количественную оценку степени их взаимодействия.
Целью данной работы является разработка метода количественной оценки взаимодействий in vivo белков-онкомаркеров HP1α и HP1β.
В экспериментах по экспрессии белков HP1α, HP1β и Tap54β, слитых с BAP и BirA в клетках HEK293T, обнаружено повышение уровня биотинилирования, обусловленное in vivo взаимодействием гомологичных белков BAP-HP1 и BirA-HP1 (BAP-Tap54β и BirA-Tap54β). Отношение сигналов гетерологичного к гомологичному взаимодействию во всех повторных экспериментах составляло 0,4±0,14 (для образцов, содержащих BAP-HP1α) и 0,32±0,08 (для образцов с BAP-HP1β). Методом LC-MS/MS проведен качественный анализ фрагментов геля, соответствующих участкам иммуноблота с сигналами экспрессируемых белков и идентифицированы пептиды, соответствующие BAP, Tap54β,  HP1α и HP1β.
Ключевые слова: гетерохроматин, эухроматин, белок-белковые взаимодействия, биотинилирование, онкомаркеры, биотин-лигаза, пептид акцептора биотина, плазмиды, транзиентная трансфекция, иммуноблот, тандемная хроматомасс-спектрометрия.

 

METHOD OF QUANTITATIVE EVALUATION OF HETEROCHROMATIN PROTEIN HP1 INTERACTIONS IN VIVO


A.T. Kulyyassov 1, G.S. Zhubanova 1, E.M. Ramankulov 1, V.V. Ogryzko 2
1 National Center for Biotechnology under the Science Committee of Ministry of Education and Science of the Republic of Kazakhstan, 13/1 Valikhanov str., Astana, 010000, Kazakhstan 
Institut Gustave Roussy, CNRS UMR8126, 94805, Villejuif, France, 39 Rue Camilles Desmoulin

This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

ABSTRACT

The development and progression of cancer is accompanied by changes in gene expression which are often can be caused by both genetic and epigenetic alterations and therefore proteins НР1α, β и γ are potential oncomarkers.
We have used method, called the Proximity Utilizing Biotinylation (PUB), based on co-expression within a single cell of the recombinant proteins - the protein of interest fused with biotin ligase BirA and his partner with the biotin acceptor peptide BAP, which allows an accurate quantitative assessment of the extent of their interaction in vivo.
The aim of this work is to develop a method for quantifying interactions in vivo of oncomarker proteins HP1α and HP1β.
In experiments on protein expression of BAP and BirA fusions of HP1α, HP1β and Tap54β in HEK293T cells we found elevated levels of biotinylation due to in vivo interaction of homologous proteins BAP-HP1 and BirA-HP1 (BAP-Tap54β and BirA-Tap54β). Signal ratio of heterologous to homologous interaction in all repeated experiments was 0,4 ± 0,14 (for samples containing BAP-HP1α) and 0,32 ± 0,08 (for samples with BAP-HP1β). Qualitative analysis by LC-MS/MS method of the gel fragments corresponding to the immunoblot bands of expressed proteins allowed to identify peptides relevant to BAP, Tap54β,   HP1α and HP1β.
Keywords: heterochromatin, euchromatin, protein-protein interactions, biotinylation, oncomarkers, biotin ligase, biotin acceptor peptide, plasmids, transient transfection, western blot, mass spectrometry.


 

ВВЕДЕНИЕ

Геном человека состоит из 20,000-30,000 генов, кодирующих свыше 500,000 различных белков, из которых более чем 10,000 производится в любой данный момент времени (клеточная «протеóма»). По приблизительной оценке более 80% белков не функционируют по отдельности, а участвуют в образовании комплексов [1-2]. Эти белок-белковые взаимодействия регулируются различными механизмами. Например, связывание с ионами металлов или пост-трансляционные модификации (ПТМ) могут приводить к конформационным изменениям, которые увеличивают афинность, кооперативность и кинетику взаимодействий. Многие белок-белковые взаимодействия являются частью и основой более крупных внутриклеточных сетей взаимодействий (интерактóм) и неполадки внутри них приводят к возникновению различных заболеваний [3-5]. Наглядные примеры образования белковых комплексов и интерактóм связаны с процессами формирования хроматина в ядре клетки.

Эукариотические геномы упакованы в два типа хроматина: эухроматин и гетерохроматин, которые отличаются сиквенсом, модификацией гистонов и ассоциацией с хромосомными белками [6]. Богатый генами эухроматин упакован нуклеосомами, содержащими гистон Н3, метилированный при лизине 4 (H3K4me), являющийся эпигенетическим маркером, характерный для промотеров генов, несущих РНК-полимеразу II. И наоборот, обедненный генами гетерохроматин упакован нуклеосомами, содержащими гистон Н3, метилированный при лизине 9 (H3K9me). Модификации гистоновых хвостов изменяют упаковку хроматина и белок-белковые взаимодействия регулирующие процессы на хроматине. Идентифицированы несколько белков, которые специфически связываются с модификациями гистоновых хвостов. Одним из них является гетерохроматиновый белок НР1, эволюционно-консервативный негистоновый хромосомный белок, который в основном присутствует в гетерохроматине, а также в специфических участках эухроматина [7-11].

Белки НР1 образуют семейство на основании наличия в их структуре двух консервативных доменов (рисунок 1): хромодомена (CD) и хромошэдоу домена (CSD), разделенных гибким звеном [12]. Первый представитель этого семейства был выделен из плодовой мухи Drosophila melanogaster и называется НР1α [13]. Геном мыши кодирует три вида НР1α, НР1β и НР1γ с функциями, аналогичными белкам из Drosophila [14]. Родственные три вида белков НР1 закодированы также в геноме человека [15-17]. В клетках млекопитающих уменьшение уровня НР1 приводит к дефектам сегрегации хромосом. Нокдаун гена как НР1α, так и НР1γ в клетках HeLa отменяет локализацию кинетохорного белка hMis12, связывающейся с НР1, что приводит к сегрегации хромосомы [18]. Все это свидетельствует о том, что НР1 необходим для стабильности центромер в различных организмах, чтобы укрепить хроматиновую структуру.

Figure 1. Alignment of amino acid sequences from sequence data of three heterochromatin protein HP1 paralogues’ containing plasmids: pcDNA3.1(+).BAP.HP1α/HP1β/HP1γ. Matches (depicted as asterisks) grouped into two domains: CD-domain, recognizing methylated lysine at position 9 of H3 histone (H3K9me) and CSD-domain, responsible for dimerization and oligomerization of HP1 molecules. Hinge – flexible part between two domains. For alignment of nucleotide and amino acid sequences, the program MEGA4 (freely available online) was used.
Figure 1. Alignment of amino acid sequences from sequence data of three heterochromatin protein HP1 paralogues’ containing plasmids: pcDNA3.1(+).BAP.HP1α/HP1β/HP1γ. Matches (depicted as asterisks) grouped into two domains: CD-domain, recognizing methylated lysine at position 9 of H3 histone (H3K9me) and CSD-domain, responsible for dimerization and oligomerization of HP1 molecules. Hinge – flexible part between two domains. For alignment of nucleotide and amino acid sequences, the program MEGA4 (freely available online) was used

 

Развитие и прогрессирование рака прежде всего связано с изменениями в экспрессии генов, которые часто являются следствием генетических и эпигенетических отклонений [19], и, следовательно, белки НР1 можно использовать как онкомаркеры. Большинство транскрипционных факторов не являются ген-специфическими, дефект одного фактора имеет последствия для экспрессии многих генов. Дефекты в белке упаковщике хроматина или ферменте модифицирующего гистоны могут изменить хроматиновый статус многих областей генома, одновременно влияя на экспрессию сотен генов [20]. Однако, несмотря на значительный прогресс в исследованиях по онкомаркерам, имеются также противоречивые результаты. Так, например, в работе [21] сообщается, что для клеток карциномы рака молочной железы наблюдается повышенная экспрессия белка HP1α, хотя согласно результатам других авторов, уровень этого белка понижен [22]. Все это свидетельствует о недостаточной точности используемых на сегодняшний момент количественных методов диагностики рака, что обуславливает необходимость разработки новых, более совершенных способов определения не только уровня экспрессии онкомаркеров, но и их белок-белковых взаимодействии in vivo.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование ДНК

Для получения генов CBX5 и  CBX1 с целью последующего их субклонирования был проведен дизайн олигонуклетидов-праймеров, содержащих сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции XhoI и NotI. Молекулярно-генетический дизайн и анализ результатов сиквенса ДНК проводили с помощью доступного в режиме online программного обеспечения MEGA4.

Олигонуклеотиды-праймеры:

CBX5 (HP1α), подчеркнуты сайты рестрикции XhoI и NotI

HP1a-XhoI  CACACACACTCGAGATGGGAAAGAAAACCAAGCGGACAGC

HP1a-NotI  CACACACAGCGGCCGCTTAGCTCTTTGCTGTTTCTTTCTCTTT

CBX1 (HP1β), подчеркнуты сайты рестрикции SalI и NotI

HP1b_FD   CACACACAGTCGACGGCATGGGGAAAAAACAAAAC

HP1b_RS   TGTGTGTGGCGGCCGCTTAGTTCTTGTCATCTTTTTTG

Для ПЦР-амплификации генов CBX5 и CBX1 в качестве матриц использовали плазмиды pBBHN.HPlα и pBBHN.HPlβ [23]. Полученные ампликоны генов CBX5 и CBX1 клонировали в вектора pcDNA3.1(+).BAP и pcDNA3.1(+).BirA.

Протокол реакции синтеза гена.

Смесь 1. Праймеры (HP1a-XhoI, HP1a-NotI или HP1b_FD, HP1b_RS) – 0,5 мкл, pBBHN.HPlα или pBBHN.HPlβ (200 мкг), Н2О – 23,0 мкл, dNTP (25 мМ) – 1,0 мкл. Общий объем – 25,0 мкл.

Смесь 2. Буфер ПЦР с KCl (10х) – 5,0 мкл, MgSO4 – 5,0 мкл, Taq ДНК-полимераза (Thermo scientific, EP0402) – 0,3 мкл, Н2О – 14,7 мкл. Общий объем – 25,0 мкл.

Смешали смеси 1 и 2, затем загрузили в ПЦР амплификатор. Условия ПЦР: предварительная денатурация 95°С – 2 минуты, денатурация 95°С - 15 сек, отжиг 50°С - 30 сек, элонгация 72°С – 90 сек, количество циклов – 25, финальная элонгация 72°С – 10 минут.

Часть продуктов ПЦР-реакции (10 мкл или 1/5 часть от объема) отобрали для контрольного электрофореза (1%-ный агарозный гель). Оставшуюся часть ПЦР-продуктов (40 мкл) помещали в пробирки с фильтрующими элементами из набора для очистки продуктов ПЦР (Millipore, P36461, Rev. A, 03/05) и добавили 300 мкл воды. Центрифугировали при 1000 g, в течение 15 мин, для удаления солей и праймеров. Далее в фильтрующий элемент, содержащий амплифицированную ДНК, добавили 20 мкл воды, переворачивали, вставили в новую пробирку из набора и центрифугировали 2 мин при 1000 g.

Векторную ДНК pcDNA3.1(+).BAP.H2Az (1 мкг), а также продукт ПЦР-амплификации гена CBX5 подвергали гидролизу рестриктазами XhoI и NotI (20 е.а. в 20 мкл реакционной смеси) в соответствующих буферных растворах при 37°С в течение 2 часов. В случае CBX1 вместо XhoI использовали SalI. Гидролизат разделяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле, затем окрашивали с помощью бромистого этидия [24]. Визуализированные в УФ-свете фрагменты вырезали, помещали кусочки геля в пробирки, из набора для выделения ДНК из агарозного геля (Millipore, LSKGEL050) и центрифугировали при 5000 g, 10 мин. Лигирование полученных на предыдущей стадии вектора и фрагмента ДНК осуществляли с помощью лигазы фага Т4 (Thermo scientific, EL0011) в течение ночи при 4°С.

После трансформации компетентных клеток E. coli штамма DH5α и отбора клонов, несущих рекомбинантные плазмиды со встроенным геном, получили плазмиды pcDNA3.1(+).BAP.НР1α (НР1β) или pcDNA3.1(+).BirA.НР1α (НР1β). Первичную структуру ДНК определяли с использованием наборов BigDye v.3.1 (Life technologies, 4337455) на автоматических анализаторах ДНК AB3730xl (Applied Biosystems) с использованием праймеров pcDNA3.1_FP (5’ CTCTGGCTAACTAGAGAAC 3’) и primer2EMC (5’ AGACGGCAATATGGTGGA 3’).

Вектора, не содержащие эндотоксинов, нарабатывали с помощью наборов для выделения плазмидной ДНК (Sigma, PLED35-1KT или Qiagen, 12362), согласно протоколам, приведенным в инструкциях или на сайтах компаний-производителей.

Транзиентная трансфекция клеток HEK293T

Экспрессию рекомбинантных белков из полученных плазмид pcDNA3.1(+).BAP.HР1α, pcDNA3.1(+).BirA.HР1α, pcDNA3.1(+).BAP.Tap54β и pcDNA3.1(+).BirA.Tap54β осуществляли в клетках HEK293T (Human embryonic kidney cells линия 293Т) с помощью кальций-фосфатного метода.

Для приготовления среды взяли бутыль, содержащую 500 мл DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/мл, добавили 50 мл (10%) диализованной эмбриональной телячьей сыворотки, не содержащей биотин (Fetal Bovine Serum, FBS), и 5 мл (1%) смеси антибиотиков стрептомицина и ампициллина (PS). Диализ 100 мл сыворотки проводили в диализной трубке (Servapor, 16 мм, 44145.01) при перемешивании, помещенной в стакан с 3 литрами PBS буфера, который меняли три раза на свежий раствор через каждые 9-15 часов. Затем содержимое диализного мешка отфильтровали через стерильный фильтр Millipore Express TM 0,22мкм. В дальнейшем диализованную и не содержащую биотин сыворотку нагревали 15 мин при 55°С и хранили при +4°C. Для приготовления клеток пробирку с НЕК293Т из Дьюара быстро разморозили при 37°C, затем центрифугировали при 200 rcf 3 минуты и удалили супернатант (удаление ДМСО). Используя пипетку на 5 мл, ресуспендировали 1 мл клеток в среде DMEM. Перенесли суспензию с клетками во флакон Т75, добавили дополнительно среды DMEM до объема 20 мл и поместили в инкубатор на 37°C (СО2 - 4,8%).

За 1 день до трансфекции посеяли 200,000 клеток HEK293T в каждую лунку 6-луночной планшеты в 2 мл среды DMEM с 10% FBS и 1% PS. На следующий день за 1 час до трансфекции поменяли среду на 2 мл свежей DMEM. Затем в расчете на 1 лунку приготовили по две пробирки на 1,5 мл, промаркированные 0А, 0В (1А, 1В или 2А, 2В). В одну пробирку (раствор А) загрузили 220 мкл воды, 31 мкл 2М раствора хлорида кальция и необходимое количество плазмидных ДНК. Причем плазмиды с BAP-мишенями брали в количестве 0,5 мкг, а плазмиды с биотин-лигазой (BirA) в количестве 0,1 мкг в расчете на 1 лунку планшеты. Во вторую пробирку (раствор B) загрузили 250 мкл буферного раствора HBS 2x (Hepes 2 г, KCl 0,15 г, Глюкоза 0,4 г, NaCl 3,2 г, Na2HPO4 0,0426 г, pH должно составить 5,9, довели pH до 7,0 добавлением небольшими порциями 1M раствора NaOH, отфильтровали через стерильный фильтр фирмы Millipore и хранили при 4°C). Затем медленно по каплям добавляли раствор А к раствору В, оставили на 15 минут и добавили полученную смесь к клеткам HEK293T.

На следующий день поменяли среду на свежую DMEM. Через 40 часов поменяли среду на DMEM, приготовленную добавлением 10 мкл раствора биотина (1мг/мл) и 100 мкл 50 мМ HEPES (рН 7,35) к 2 мл среды (мечение биотином 8 часов).

Подготовка образцов на Вестерн-блот

Клетки собирали через 48 часов, удалили среду, затем добавили 1 мл раствора PBS, ресуспендировали и перенесли в пробирку на 1,5 мл. Затем пробирки центрифугировали при +4°С, 700 rcf, 5 минут, удалили супернатант и добавили к клеткам по 100 мкл раствора буфера CSK (100 mM NaCl, 300 mM сахароза, 10 mM Tris, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1,2 mM PMSF), содержащего 0,5% тритона, пипетировали несколько раз и центрифугировали при 4000 rpm, 5 минут. В результате на данном этапе метода были получены ядра клеток HEK293T, которые можно было заморозить до -20°С или сразу добавить 80 мкл буфера CSK без тритона, подвергнуть соникированию (для разрушения геномной ДНК и уменьшения вязкости) и добавить 40 мкл загрузочного буфера 3Х (на 10 мл буфера взяли 2,4 мл 1М Трис, рН 6.8, 0,8 г SDS, 4 мл глицерина, 0,01% бромфенолового синего, 1 мл бета-меркаптоэтанола и 2,8 мл воды). Пробирки встряхнули, нагрели при 98°С (5 минут) и открутили на миницентрифуге на максимальной скорости. Анализ лизатов ядер с помощью иммуноблота проводили согласно методике из сборника [25]. За день до проведения белкового электрофореза приготовили стеклянные кассеты (BioRad, 165-8000) с полиакриламидными гелями (толщина геля 1,0 мм). Расчет компонентов для 12%-ного полиакриламидного геля (разделяющий гель) в расчете на 1 кассету: Акрил/Бисакрил (30%) - 4,0 мл, ТрисHCl, 1,5M, pH 8,8 - 2,5 мл, H2O - 3,4 мл, 10% SDS - 100 мкл, 10% APS - 50 мкл, TEMED - 5 мкл. Расчет компонентов для 4%-ного полиакриламидного геля (концентрирующий гель) в расчете на 1 кассету: Акрил/Бисакрил (30%) - 0,65 мл, ТрисHCl, 0,5M, pH 6,8 - 1,25 мл, H2O - 3,05 мл, 10% SDS - 50 мкл, 10% APS - 50 мкл, TEMED - 10 мкл.

Затем загрузили по 10 мкл образцов на гель, заполнили камеру электродным буферным раствором (на 1 литр 10x раствора брали 30 г Tris, 144 г глицина и 10, 5 г SDS) и проводили электрофорез при напряжении 100 вольт 120 минут. Параллельно загрузили по 20 мкл образцов для хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). В качестве молекулярного маркера использовали окрашенную смесь белков от 10 до 250 кДа (Fermentas, 26619), которую наносили посередине геля (в дальнейшем гель разрезали посередине дорожки, где левую часть геля использовали для вырезания фрагментов, содержащих белки Tap54β и НР1, и последующего анализа на LC-MS/MS, а правую часть для иммуноблота). После окончания электрофореза кассету с гелем вытащили из камеры, вскрыли и гель аккуратно переложили на предварительно подготовленную нитроцеллюлозную мембрану (Amersham Biosciences, 0,45 micron, RPN303c). Кассету для иммуноблота поместили в специальную камеру, залили туда буферного раствора для переноса (на 1 литр 1x раствора брали 3 г Tris, 14,4 г глицина, 1,5 г SDS и 200 мл этанола) до требуемого уровня, подключили к источнику тока и проводили перенос при напряжении 100 вольт и силе тока 350 мА в течение 110 минут. После окончания переноса мембрану блокировали с использованием раствора, содержащего PBS, 0,2% твина и 5% обезжиренного молока и оставили на ночь при перемешивании на шейкере при +14°С.

На следующий день мембрану промыли трижды по 15 мл раствора PBS c 0,2% твина. Затем добавили 10 мл раствора PBS c 0,2% твина и 2 мкл стрептавидин-HRP (Invitrogen, 43-4323) или анти-His-HRP (QiaGen, 34460) и перемешивали на шейкере 45 минут. После обработки мембраны стрептавидин-HRP (или анти-His-HRP) ее промыли дважды 10-15 мл раствора PBS+0,5M NaCl (10 мин) и дважды 10-15 мл раствора PBS без NaCl (15 мин). Обработали мембрану смесью, состоящей из 500 мкл Luminol/enhancer solution и 500 мкл Stable peroxide buffer (Applichem, A3417, 1200). Поместили мембрану в тонкую прозрачную полиэтиленовую пленку и фиксировали сигнал на мембране, помещая ее в кассету с фотопленкой (в темноте). Для получения отчетливой картины проводили выдержку фотопленки на мембране с трехкратным увеличением продолжительности экспозиции (5, 15, 45 и 135 секунд). Пленку проявляли на проявочной машине. Для денситометрического анализа иммуноблотов использовали доступную в online программу ImageJ 1.47v.

Подготовка образцов для хромато-масс-спектрометрии

Фрагмент геля с дорожкой от цветного белкового маркера отмывали в 30 мл дистиллированной воды 2 часа. Затем воду слили и с помощью скальпеля вырезали куски геля, ориентируясь на сигналы белков Tap54b и НР1 на Вестерн-блоте относительно цветного белкового маркера. Вырезанные куски геля помещали в пробирки Эппендорф на 1,5 мл без кератина. Промывку кусков геля осуществляли сначала 100 мкл смеси ацетонитрил:50 мМ бикарбонат аммония (1:1) в течение 10 мин, затем удалили супернатант и добавили 100 мкл чистого ацетонитрила и перемешивали 10 минут при комнатной температуре. Повторили промывку 3 раза, а затем поместили образцы на SpeedVac на 5 минут для удаления остаточного ацетонитрила. Затем в каждую пробирку добавили по 100 мкл активированного трипсина [26-27]. Активированный трипсин получали прибавлением 15 мкл 190 мМ раствора бикарбоната аммония к 100 мкл раствора гидрохлорида трипсина (Promega, V5280) с концентрацией 13,33 нг/мкл. Пробирки поместили в термошейкер на 3 часа при 37°С при интенсивном перемешивании. После этого пробирки открутили на центрифуге, а супернатант перенесли в специальную пробирку для анализа на масс-спектрометре. Затем поместили образцы на SpeedVac и открутили пробирки под вакуумом досуха (около 40-60 минут при 40°С). В каждую пробирку прибавили по 7 мкл раствора для анализа (CH3CN:H2O:HCOOH, 3:97:0,1%) и поместили пробирки в автосэмплер хроматомасс-спектрометра (Agilent nanoHPLC 3D 6340 IonTrap). Отнесение пиков на масс-спектрах и идентификацию пептидов после MRM осуществляли их сравнением с теоретически рассчитанными спектрами MS2, полученными с помощью программы Biolynx. Параметры наноВЭЖХ: режим MicroFlow Mode, скорость потока в колонке – 0,3 мкл/мин, время остановки – 34 мин, диапазон давления минимум – 0 бар, максимум – 150 бар; растворители A: H2O+0,1% HCOOH, B: 90% CH3CN+10% H2O; график времени – 0 мин - 3% B, 25 мин - 55% B, 30 мин - 95% B, 30,01 мин - 3% B.

MS/MS-спектры пептидов: m/z (интенсивность %, yn, bm):

BAP1070-биотинилированный

-.ILEAQK(Biotin)IVR.- время удерживания tR – 9,7 мин

1183.7 (3, y8), 1121.7 (100, b8), 1069.6 (71, y7), 1023.7 (37, b7), 940.7 (78, y6), 909.6 (41, b6), 869.5 (37, y5), 741.5 (64, y4), 665.4 (46, b6-biotinyl group-H2O), 470.8 (10, y6++), 427.3 (14, b4), 387.4 (64, y3), 356.2 (14, b3), 274.2 (81, y2), 227.1 (31, b2)

Ruv B-like2 (Tap54b)

-.GLGLDDALEPR.- время удерживания tR – 9,5 мин

985.5 (16, y9), 928.4 (12, y8), 884.4 (30, b9), 815.5 (75, y7), 700.4 (24, y6), 585.3 (24, y5), 514.4 (30, y4), 456.4 (7, b5), 401.3 (54, y3), 272.2 (100, y2)

-.DKVQAGDVITIDK.- время удерживания tR – 6,7 мин

1158.7 (64, y11), 931.6 (100, y9), 860.5 (85, y8), 688.5 (52, y6), 589.5 (17, y5), 476.3 (45, y4), 375.2 (11, y3), 343.2 (24, b3), 262.1 (10, y2)

-.VYSLFLDESR.- время удерживания tR – 10,9 мин

1054.3 (4, b9), 966.5 (84, y8), 879.5 (36, y7), 838.7 (5, b7), 766.5 (100, y6), 506.2 (76, y4), 391.3 (24, y3), 350.3 (20, b3), 262.2 (24, y2)

HP1α (CBX5)

-.GFSEEHNTWEPEK.- время удерживания tR – 6,0 мин

1443.6 (12, b12), 1217.5 (100, b10), 1041.5 (30, y8), 903.4 (30, y7), 373.3 (97, y3)

-.WKDTDEADLVLAK.- время удерживания tR – 8,6 мин

1357.6 (9, b12), 1189.7 (100, y11), 1074.6 (45, y10), 961.4 (15, b8), 858.6 (79, y8), 646.4 (27, b5), 543.5 (33, y5), 430.4 (12, y4)

HP1β (CBX1)

-.NSDEADLVPAK.- время удерживания tR – 5,4 мин

957.5 (21, y9), 845.4 (36, b8), 745.4 (12, b7), 713.5 (24, y7), 642.4 (15, y6), 446.2 (6, b4), 414.3 (21, y4), 315.2 (100, y3)

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Широко используемые в настоящее время способы мониторинга белок-белковых взаимодействий внутри живой клетки, включают такие методы как FRET, BRET и различные виды двухгибридных систем, и таким образом предоставляют достоверные данные о пространственной организации клетки [26-27]. Однако указанные методы имеют недостатки, как, например, то, что они предоставляют информацию о внутри- и межмолекулярных взаимодействиях на расстояниях 1-10 нм. Разработанный нами метод, названный Proximity Utilizing Biotinylation (PUB) или биотинилирование от сближения (взаимодействия) белков in vivo, является усовершенствованием методики, опубликованной ранее [28-29]. PUB основан на коэкспрессии внутри одной клетки рекомбинантных белков - интересующего белка с биотин лигазой BirA и его партнера с пептидом акцептором биотина BAP, что позволяет провести точную количественную оценку степени их взаимодействия [30-31], а также анализировать состав хроматина вблизи определенных белков [32]. Преимуществом предложенного метода является возможность использования, наряду с иммуноблотом, также LC-MS/MS, позволяющую осуществлять мультиплексный анализ (с использованием различных вариантов пептидов BAP) или анализ с применением стабильных изотопов (Stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture, SILAC) и проводить одновременный мониторинг нескольких взаимодействий в одном эксперименте.

Figure 2. Top: Design and principle of PUB on the example of homo- (2a-2b) and heterologous (2c) interactions of HP1 and Tap54 (RuvBlike) proteins. In vivo interactions of HP1 and Tap54 proteins fused with biotin-ligase (BirA) and Biotin Acceptor Peptide (BAP) in HEK293T cells are detected by measuring of biotinylation level on Western-blot or mass spectrometry. Bottom: 2d. Design of vectors for transfection of eukaryotic cells on the example of construction with CBX5 gene, encoding sequence of heterochromatin protein HP1alpha, fused with BAP or BirA. Vector is constructed on the basis of standard plasmid pcDNA3.1(+) with CMV promoter. Plasmids encoding Tap54β or other genes are made by exchange of ORF between restriction sites XhoI and NotI.
Figure 2. Top: Design and principle of PUB on the example of homo- (2a-2b) and heterologous (2c) interactions of HP1 and Tap54 (RuvBlike) proteins. In vivo interactions of HP1 and Tap54 proteins fused with biotin-ligase (BirA) and Biotin Acceptor Peptide (BAP) in HEK293T cells are detected by measuring of biotinylation level on Western-blot or mass spectrometry. Bottom: 2d. Design of vectors for transfection of eukaryotic cells on the example of construction with CBX5 gene, encoding sequence of heterochromatin protein HP1alpha, fused with BAP or BirA. Vector is constructed on the basis of standard plasmid pcDNA3.1(+) with CMV promoter. Plasmids encoding Tap54β or other genes are made by exchange of ORF between restriction sites XhoI and NotI

 

Для подтверждения того, что метод PUB может обнаруживать специфическое белок-белковое взаимодействие, мы использовали несколько экспериментальных систем, один из которых основан на белках, образующих олигомеры (рисунки 2a, 2b). Одним из таких белков является гетерохроматиновый белок НР1, который в человеческих клетках существует в виде 3 гомологичных форм или паралогов - α, β и γ, образующий олигомеры посредством взаимодействия через CSD домен (рисунок 1) [19, 34, 35]. Ортолог белка HP1β в Schizosaccharomyces pombe (делящиеся дрожжи) Swi6 обладаeт схожими свойствами и выполняeт аналогичные функции [36].

HP1α является прогностическим маркером на наличие рака в организме человека [37], изменение экспрессии которого в опухолевых клетках, в сравнении со здоровыми клетками позволяет достоверно диагностировать рак молочной железы и опухоль мозга, рак мочевого пузыря, яичников и поджелудочной железы, и ряд других заболеваний [19].

Недавние исследования свидетельствуют также, что белки семейства НР1 играют критически важную роль в процессах, связанных с репрограммированием в плюрипотентное состояние [38-39].

Figure 3. Biotinylation levels are interaction/proximity dependent.
Top, left (3a): Western-blot of HEK293T cell nuclear lysates, NS – nonspecific signal; 0 – control BAP-HP1α+ BAP-HP1βwithout biotin-ligase BirA. Biotin pulse – 8 hr. Right, top and bottom (3b-3c): Quantitative evaluation of biotinylation level. The signal intensities were first measured by densitometry with the program ImageJ 1.47v (freely available online), then the streptavidin signal for every BAP-fusion was normalized by dividing it by the a-His signal; E – the ratio between biotinylation of BAP-Tap54β in samples with BirA-Tap54β and BirA-HP1; F - the ratio between biotinylation of BAP-HP1 in samples with BirA-Tap54β and BirA-HP1; G - the ratio between biotinylation of BAP-HP1 and BAP-Tap54β in the presence of BirA-Tap54β; H - the ratio between biotinylation of BAP-HP1 and BAP-Tap54β in the presence of BirA-HP1; 1 – transfection with HP1α; 2 – transfection with HP1β. Left, bottom (3d): Ratio between the efficiencies of heterologous (Tap54β vs HP1) and homologous (Tap54β vs Tap54β and HP1 vs HP1) biotinylation. Shown are average values of F/E (transfection with HP1α) and F’/E’ (transfection with HP1β) calculated for three experiments
Figure 3. Biotinylation levels are interaction/proximity dependent.
Top, left (3a): Western-blot of HEK293T cell nuclear lysates, NS – nonspecific signal; 0 – control BAP-HP1α+ BAP-HP1βwithout biotin-ligase BirA. Biotin pulse – 8 hr. Right, top and bottom (3b-3c): Quantitative evaluation of biotinylation level. The signal intensities were first measured by densitometry with the program ImageJ 1.47v (freely available online), then the streptavidin signal for every BAP-fusion was normalized by dividing it by the a-His signal; E – the ratio between biotinylation of BAP-Tap54β in samples with BirA-Tap54β and BirA-HP1; F - the ratio between biotinylation of BAP-HP1 in samples with BirA-Tap54β and BirA-HP1; G - the ratio between biotinylation of BAP-HP1 and BAP-Tap54β in the presence of BirA-Tap54β; H - the ratio between biotinylation of BAP-HP1 and BAP-Tap54β in the presence of BirA-HP1; 1 – transfection with HP1α; 2 – transfection with HP1β. Left, bottom (3d): Ratio between the efficiencies of heterologous (Tap54β vs HP1) and homologous (Tap54β vs Tap54β and HP1 vs HP1) biotinylation. Shown are average values of F/E (transfection with HP1α) and F’/E’ (transfection with HP1β) calculated for three experiments

 

Для экспериментов по белок-белковым взаимодействиям in vivo мы сконструировали два типа векторов: один для экспрессии BAP-слитых мишеней, а другой для BirA-слитых белков (рисунок 2d), которые содержат следующие элементы:

  • HP1alpha – нуклеотидная последовательность гена CBX5 (Chromobox homolog 5) или любого другого белка, который можно клонировать между сайтами XhoI и NotI с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Рамка считывания (ORF) гена белка HP1α составляет 575 п.н., а масса белка 22,23 кДа. Для случая клонирования гетерохроматинового белка HP1β использовали праймеры с сайтами рестрикции SalI и NotI, в связи с наличием XhoI сайта внутри рамки считывания этого гена. ORF HP1β – 558 п.н., а масса белка 21,42 кДа;
  • BAP1070 (Biotin Acceptor Peptide) – домен пептида акцептора биотина, который содержит также гептагистидиновый маркер 7His-tag (рисунок 4), для возможности мониторинга или выделения рекомбинантных белков вне зависимости от наличия биотиновой метки [31];
  • CMV (Cytomegalovirus enhancer-promoter) цитомегаловирусный промотор;
  • EMC IRES (Encephalomyocarditis Internal Ribosome Entry Site) - последовательность бицистронного транскрипционного элемента, позволяющего экспрессировать два белка из одного транскрипта;
  • IL2R (Interleukin-2 Receptor) - селекционный маркер;
  • Amp(R) – селекционный маркер гена устойчивости к ампициллину.

 

Плазмиды pcDNA3.1(+).BAP.Tap54β и pcDNA3.1(+).BirA.Tap54β получены субклонированием из вектора pOzFHHN.BAP.Tap54β и pOzFHHN.BirA.Tap54β, которые в последующих экспериментах по экспрессии в эукариотических клетках использовали как дополнительный внутренний контроль для более точной количественной оценки взаимодействия НР1-НР1. Рамка считывания (ORF) гена белка Tap54β составляет 1406 п.н., или 463 аминокислотных остатка, а масса белка 51,1 кДа.

Белок Tap54β (RuvB-like2) обладает АТФ-азной и АТФ-зависимой ДНК-геликазной активностью. Образование гексамеров (рисунок 2b) и додекамеров с близкородственным Tap54α (RuvB-like 1) является критически важным этапом для гидролиза АТФ и субъединицы кольцевой структуры гексамера обуславливают АТФ-азную активность [40-42]. Этот белок является компонентом гистонацетилтрансферазного комплекса NuA4, вовлеченного в транскрипционную активацию выбранных генов в основном ацетилированием нуклеосомальных гистонов Н4 и Н2А [41].

Гетерохроматиновые белки НР1α и НР1β также образуют олигомеры [12, 43] благодаря наличию в структуре CSD домена (рисунок 2а). Однако белки Tap54β и НР1α (НР1β) не взаимодействуют друг с другом (рисунок 2c), что в случае гетерологичной коэкспрессии BAP-HP1α и BirA-Tap54β должно приводить к уровню биотинилирования сравнимого с фоновым, в то время как гомологичная коэкспрессия BAP-HP1α и BirA-HP1α должна приводить к высокому уровню биотинилирования in vivo. Во второй плазмиде BirA – это биотин-лигаза, фермент, присоединяющий биотин к пептиду BAP. Идея эксперимента заключалась в одновременной коэкспрессии в одной клетке трех рекомбинантных белков (2 белков BAP-HP1 и BAP-Tap54β, в присутствии третьего BirA-HP1 либо BirA-Tap54β), для того чтобы исключить возможность того, что разница в уровнях биотинилирования обусловлена различным уровнем экспрессии BirA-HP1 и BirA-Tap54β между разными образцами трансфекции, аналогично тому как это проводилось ранее для белка HP1γ [31].

На рисунке 3 приведены результаты иммуноблота образцов, полученных из ядер клеток HEK293T. В верхней левой части (рисунок 3а) мембрана, обработанная антителами на полигистидиновый фрагмент, присутствующий в пептиде BAP, показывает общий уровень экспрессии белков BAP-HP1 и BAP-Tap54β. NS – это неспецифический эндогенный белок, присутствующий также и в контроле (образец 0), где только обнаружены белки BAP-HP1α и BAP-HP1β. Интенсивности сигналов в образцах 1 и 2 (а также в другой паре 3 и 4) примерно идентичны, что указывает на одинаковую экспрессию белков BAP-HP1 (в то же время во всех образцах 1-4 обнаружено примерно одинаковое количество белка BAP-Tap54β). Следует также отметить, что на мембране, обработанной полигистидиновым антителом, наблюдается также сигнал рекомбинантного белка BirA-Tap54β (самый верхний сигнал в образцах 1 и 3 на верхней мембране a-His-HRP), поскольку в нем имеется октагистидиновый маркер (8-His) между рамками считывания BirA и Tap54b, как указано на карте правой плазмиды на рисунке 2d. Однако сигналы белков BirA-HP1α и BirA-HP1β, согласно расчетам, должны наблюдаться немного выше сигнала BAP-Tap54β, но они совпали с массой неспецифического эндогенного белка NS (образцы 2 и 4 на рисунке 3a). В нижнем иммуноблоте приведена мембрана, обработанная стрептавидином, коньюгированным с пероксидазой HRP (или антибиотин). Интенсивность сигнала на мембране, обработанной на антибиотин, указывает на уровень биотинилирования, осуществляемый биотин-лигазой BirA мишеней ВАР, который тем выше, чем чаще происходит сближение рекомбинантных беков in vivo. Как и следовало ожидать, для контроля (образец 0), где нет экспрессии BirA-слитых белков, отсутствует сигнал биотинилированных белков HP1, несмотря на высокий общий уровень экспрессии BAP-HP1, согласно иммуноблоту на антигистидиновый маркер (рисунок 3a). На мембране, обработанной на антибиотин, наблюдается явное усиление сигнала, обусловленное взаимодействием гомологичных белков BAP-HP1 и BirA-HP1 (BAP-Tap54β и BirA-Tap54β), как, например, более интенсивный сигнал BAP-Tap54β в образце 1 в сравнении с аналогичным сигналом в образце 2. И наоборот, сигнал белка BAP-HP1α в образце 2 более интенсивный в сравнении с соответствующим сигналом в образце 1. Несмотря на присутствие сравнимых количеств слитых белков BAP-Tap54β и BAP-HP1 в образцах 1-4, каждый белок гораздо сильнее биотинилируется в присутствии гомологичного белка, слитого с BirA (рисунки 3b, 3c). Причем отношения сигналов гетерологичного к гомологичному взаимодействию во всех повторных экспериментах составляли величины в пределах 0,4±0,14 и 0,32±0,08 (рисунок 3d).

Таблица 1 - Аминокислотные последовательности, значения m/z одно (MH+) и двухзарядных ионов (MS2+) и коэффициенты кросс-корреляции XC пептида BAP и пептидов белков Tap54β и HP1 для анализа методом MRM

Table 1 - Amino acid sequences, m/z values of single charged (MH +), double charged ions (MS2+) and cross-correlation coefficients XC of peptides from BAP peptide, Tap54β and HP1proteins for MRM analysis

Аминокислотная последовательность

 

Amino acid sequence

MS2+

MH+

XC

BAP1070 биотинилированный (biotinylated)

1.

-.ILEAQK(Biotin)IVR.-

648.8

1294.66

-

Ruv B-like2 (Tap54β)

2.

-.GLGLDDALEPR.-

578.30

1155.60

3.62

3.

-. DKVQAGDVITIDK.-

701.38

1401.76

3.86

4.

-.VYSLFLDESR.-

614.81

1228.62

3.98

HP1α (CBX5)

5.

-.GFSEEHNTWEPEK.-

795.35

1589.69

3.05

6.

-.WKDTDEADLVLAK.-

752.39

1503.77

3.89

HP1β (CBX1)

7.

-.NSDEADLVPAK.-

579.78

1158.56

3.43

Для идентификации экспрессируемых в клетках НЕК293Т белков Tap54β, НР1α, НР1β и пептида BAP, выбраны наиболее легко обнаруживаемые с помощью LC-MS/MS пептиды, приведенные в таблице 1. Легкость обнаружения этих пептидов определяется коэффициентом кросс-корреляции ХС, который должен быть в пределах 3,0-4,0. Прибор был настроен в режиме MRM (Multiple Reaction Monitoring), с более высокой чувствительностью обнаружения ионов прекурсоров и фрагментных ионов. Для предсказания величин m/z фрагментных ионов использовали доступную онлайн программу, позволяющую рассчитать эти значения для y и b-ионов (http://db.systemsbiology.net/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html). На основании сравнения m/z, полученных экспериментальным путем на масс-спектрометре с расчетными данными, обнаружено наличие ранее охарактеризованного биотинилированного пептида BAP [31], а также идентифицированы три пептида белка Tap54β и по два пептида белков НР1α и НР1β  (рисунок 4).

Figure 4. Hydrolysis of BAP peptide by trypsin results in formation of biotinylated peptide ILEAK(Biotin)IVR, detected on MS/MS spectrum (experimental section or [31]). Peptides after trypsinolysis of Tap54β and HP1 proteins, identified by MRM (underlined and highlighted in yellow) and Spectrum Mill (underlined with wavy line and highlighted in black) on SwissProt database. Bottom: MS2 spectrum of IIGATDSSGELMFLMK peptide from HP1β protein
Figure 4. Hydrolysis of BAP peptide by trypsin results in formation of biotinylated peptide ILEAK(Biotin)IVR, detected on MS/MS spectrum (experimental section or [31]). Peptides after trypsinolysis of Tap54β and HP1 proteins, identified by MRM (underlined and highlighted in yellow) and Spectrum Mill (underlined with wavy line and highlighted in black) on SwissProt database. Bottom: MS2 spectrum of IIGATDSSGELMFLMK peptide from HP1β protein

 

ВЫВОДЫ

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что сконструированные плазмиды CMV.BAP.A и CMV.BirA.B (где A и B - НР1α, НР1β и Tap54β) обеспечивают высокий уровень экспрессии соответствующих рекомбинантных белков, достаточный для работ, связанных с количественной оценкой их экспрессии в эукариотических клетках и изучения белок-белковых взаимодействий in vivo. По результатам экспериментов показано, что метод PUB позволяет детектировать и на основании данных иммуноблота количественно измерить гомологичное взаимодействие белков НР1 и НР1, а также Tap54β и Tap54β. С помощью метода LC-MS/MS выявлены и охарактеризованы пептиды, свидетельствующие о присутствии в полученных образцах из ядер клеток HEK293T биотинилированного фрагмента BAP, гетерохроматиновых белков HP1α, HP1β и белка Tap54β.

 

Выражение благодарности

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Республики Казахстан в рамках проекта «Разработка новых методов количественной оценки взаимодействий белка-онкомаркера лейкемии HP1» на 2012-2014 гг.

 

REFERENCES

  1. Berggerd T., Linse S., James P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics, 2007, vol. 7, issue 16, pp. 2833-2842.
    CrossRef
  2. Wodak Sh.J., Vlasblom J., Turinsky A.L., Pu Sh. Protein-protein interaction networks: the puzzling riches. Curr. Opinion in Struct. Biol., 2013, vol. 23, issue 6, pp. 941-953.
    CrossRef
  3. Navlakha S. and Kingsford C. The power of protein interaction networks for associating genes with diseases. Bioinformatics, 2010, vol. 26, no. 8, pp. 1057–1063.
    CrossRef
  4. Vidal M., Cusik M.E., Barabasi A.-L. Interactome networks and human disease. Cell, 2011, vol. 144, issue 6, pp. 986-998.
    CrossRef PubMed
  5. Gonzalez M.W., Kann M.G. Chapter 4: Protein Interactions and Disease. PLOS Computational Biology, 2012, vol. 8, issue 12, e1002819.
    CrossRef
  6. Grewal S.I., Elgin S.C. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure. Curr. Opin. Genet. Dev, 2002, vol. 12, issue 2, pp.178–187.
    CrossRef PubMed
  7. Chevillard C., Reik W., McDermott M., Fontes M., Mattei M.G., Singh P.B. Chromosomal localization of human homologs of the Drosophila heterochromatin protein 1 (HP1) gene. Mamm. Genome, 1993, vol. 4, issue 2, pp. 124–126.
    CrossRef PubMed
  8. Eissenberg J.C., Morris G.D., Reuter G., Hartnett T. The heterochromatinassociated protein HP-1 is an essential protein in Drosophila with dosage-dependent effects on position-effect variegation. Genetics, 1992, vol. 131, no. 2, pp. 345–352.
    PubMed
  9. Horsley D., Hutchings A., Butcher G.W., Singh P.B. M32, amurine homologue of Drosophila heterochromatin protein 1 (HP1), localises to euchromatin within interphase nuclei and is largely excluded from constitutive heterochromatin. Cytogenet. Cell Genet, 1996, vol. 73, no. 4, pp. 308–331.
    CrossRef PubMed
  10. James T.C., Eissenberg J.C., Craig C., Dietrich V., Hobson A., Elgin S.C. Distribution patterns of HP1, a heterochromatin-associated nonhistone chromosomal protein of Drosophila. Eur. J. Cell Biol., 1989, vol. 50, pp. 170–180.
    PubMed
  11. Mateescu B., Bourachot B., Rachez C., Ogryzko V., Muchardt C. Regulation of an inducible promoter by an HP1beta-HP1gamma switch. EMBO Rep., 2008, vol. 9, no. 3, pp. 267–272.
    CrossRef PubMed
  12. Lomberk G., Wallrath L., Urrutia R. The Heterochromatin Protein 1 family. Genome Biol., 2006, vol. 7, issue 7, pp. 228.1-228.8.
    CrossRef PubMed
  13. Vermaak D., Henikoff S., Malik H.S. Positive selection drives the evolution of rhino, a member of the heterochromatin protein 1 family in Drosophila. PLoS Genet, 2005, vol. 1, issue 1, pp. 96–108.
    CrossRef PubMed
  14. Singh P.B., Miller J.R., Pearce J., Kothary R., Burton R.D., Paro R., James T.C., Gaunt S.J. A sequence motif found in a Drosophila heterochromatin protein is conserved in animals and plants. Nucleic Acids Res., 1991, vol. 19, no. 4, pp. 789–794.
    CrossRef PubMed
  15. Minc E., Allory Y., Courvalin J.C., Buendia B. Immunolocalization of HP1 proteins in metaphasic mammalian chromosomes. Methods Cell Sci., 2001, vol. 23, issue 1-3, pp. 173–176.
    CrossRef PubMed
  16. Minc E., Allory Y., Worman H.J., Courvalin J.C., Buendia B. Localization and phosphorylation of HP1 proteins during the cell cycle in mammalian cells. Chromosoma, 1999, vol. 108, no. 4, pp. 220–234.
    PubMed
  17. Minc E., Courvalin J.C., Buendia B. HP1gamma associates with euchromatin and heterochromatin in mammalian nuclei and chromosomes. Cytogenet. Cell Genet, 2000, vol. 90, pp. 279–284.
    CrossRef PubMed
  18. Obuse C., Iwasaki O., Kiyomitsu T., Goshima G., Toyoda Y., Yanagida M. A conserved Mis12 centromere complex is linked to heterochromatic HP1 and outer kinetochore protein Zwint-1. Nat. Cell Biol., 2004, vol. 6, no. 11, pp. 1135–1141.
    CrossRef PubMed
  19. Dialynas G. K., Vitalini M.W., Wallrath L.L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research, 2008, vol.647, issue 1-2, pp. 13–20.
    CrossRef PubMed
  20. Maison Chr. And Almouzni G. HP1 and the dynamics of heterochromatin maintenance. Nature reviews/Molecular cell biology, 2004, vol. 5, pp. 296-304.
    CrossRef PubMed
  21. De Koning L., Savignoni A., Boumendil Ch., Rehman H., Asselain B.,Sastre-Garau X., Almouzni G. Heterochromatin protein 1a: a hallmark of cell proliferation relevant to clinical oncology. EMBO Mol. Med., 2009, vol. 1, issue3, pp. 178-191.
    CrossRef PubMed
  22. Kirschmann D.A., Lininger R.A., Gardner L.M., Seftor E.A., Odero V.A., Ainsztein A.M., Earnshaw W.C., Wallrath L.L., Hendrix M.J. Down-regulation of HP1Hsalpha expression is associated with the metastatic phenotype in breast cancer. Cancer Res., 2000, vol. 60, no. 13, pp. 3359-3363.
    PubMed
  23. Harel B.A., Mechold U., Viens A., Gilbert C., Lehrman H., Ogryzko V. Vectors for expression of biotinylated proteins in mammalian cells, and their use for identification of protein-nucleic acid interactions in vivo, EPO Patent 1367125-A1, 03.12.2003, 31 p.
  24. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 480 p.
  25. Higgins S.J., Hames B.D. Protein Expression. A practical approach. Oxford University Press, 1999, 282 p.
  26. Westermeier R., Naven T., Höpker H.-R. Proteomics in practice. Weinheim:Wiley-VCH Verlag-GmbH, 2008, 482 p.
  27. Von Hagen J. Proteomics sample preparation. Weinheim:Wiley-VCH Verlag-GmbH, 2008, 453 p.
  28. Viens A., Mechold U., Lehrmann H., Harel-Bellan A., Ogryzko V. Use of protein biotinylation in vivo for chromatin immunoprecipitation. Anal. Biochem., 2004, vol. 325, issue 1, pp. 68–76.
    CrossRef PubMed
  29. Viens A., Harper F., Pichard E., Comisso M., Pierron G., Ogryzko V. Use of protein biotinylation in vivo for immunoelectron microscopic localization of a specific protein isoform. J. Histochem. Cytochem., 2008, vol. 56, no. 10, pp. 911–919.
    CrossRef PubMed
  30. Kulyyassov A., Shoaib M., Ogryzko V. Use of in vivo biotinylation for chromatin immunoprecipitation. Curr. Protoc. Cell Biol., 2011, Chapter 17, Unit17.12, pp. 17.12.1-17.12.22.
    CrossRef PubMed
  31. Kulyyassov A., Shoaib M., Pichugin A., Kannouche P., Ramanculov E., Lipinski M., Ogryzko V. PUB-MS: a mass spectrometry-based method to monitor protein-protein proximity in vivo. J. Proteome Res., 2011, vol. 10, no. 10, pp. 4416-4427.
    CrossRef PubMed
  32. Shoaib M., Kulyyassov A., Robin C., Winczura K., Tarlykov P., Despas E., Kannouche P., Ramanculov E., Lipinski M., Ogryzko V. PUB-NChIP – “in vivo biotinylation” approach to study chromatin in proximity to a protein of interest. Genome Research, 2013, vol. 23, no. 2, pp. 331-340.
    CrossRef PubMed
  33. Eugene V. Koonin. Orthologs, Paralogs, and Evolutionary Genomics. Annu. Rev. Genet., 2005, vol. 39, pp. 309–338.
    CrossRef PubMed
  34. Zeng W., Ball A.R.Jr and Yokomori K. HP1 Heterochromatin binding proteins working the genome. Epigenetics, 2010, vol. 5, issue 4, pp. 287-292.
    CrossRef PubMed
  35. Ruthenburg A.J., Li H., Patel D.J., Allis C.D. Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules. Nature reviews. Molecular cell biology, 2007, vol. 8, pp. 983-994.
    CrossRef PubMed
  36. Canzio D., Liao M., Naber N., Pate E., Larson A., Wu S., Marina D. B., Garcia J. F., Madhani H. D., Cooke R., Schuck P., Cheng Y., Narlikar G. J. A conformational switch in HP1 releases auto-inhibition to drive heterochromatin assembly. Nature, 2013, vol. 496, issue 7445, pp. 377-381.
    CrossRef PubMed
  37. De Koning L., Almouzni G. HP1alpha as a prognostic marker in human cancer. US Patent US2012/0046190 A1, 23.02.2012, 30 p.
  38. Sridharan R., Gonzales-Cope M., Chronis C., Bonora G., McKee R., Huang Ch., Patel S., Lopez D., Mishra N., Pellegrini M., Carey M., Garcia B.A., Plath K. Proteomic and genomic approaches reveal critical functions of H3K9 methylation and heterochromatin protein-1γ in reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology, 2013, vol. 15, no. 7, pp. 872-882.
    CrossRef PubMed
  39. Gaspar-Maia A., Alajem A., Meshorer E., Ramalho-Santos M. Open chromatin in pluripotency and reprogramming. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 2011, vol. 12, pp. 36-47.
    CrossRef PubMed
  40. Matias P.M., Gorynia S., Donner P., Carrondo A. Crystal structure of the human AAA+ protein RuvBL1. J. Biol. Chem., 2006, vol. 281, no. 50, pp. 38918–38929.
    CrossRef PubMed
  41. Puri T., Wendler P., Sigala B., Saibil H., Tsaneva I.R. Dodecameric structure and ATPase activity of the human Tip48/Tip49 complex. J.Mol.Biol., 2007, vol. 366, issue 1, pp. 179-192.
    CrossRef PubMed
  42. Ikura T., Ogryzko V., Grigoriev M., Groisman R., Wang J., Horikoshi M., Scully R., Qin J., Nakatani Y. Involvement of the Tip60 histone acetylase complex in DNA repair and apoptosis, Cell, 2000, vol. 102, issue 4, pp. 463-473.
    CrossRef PubMed
  43. Eissenberg J.C.; Elgin S.C. The HP1 protein family: getting a grip on chromatin. Curr. Opin. Genet. Dev., 2000, vol. 10, issue 2, pp. 204–210.
    CrossRef PubMed

 

ТҮЙІН

Қатерлі ісіктің үдемелі асқынуы мен дамуы генетикалық және эпигенетикалық ауытқулардың нәтижесінде ген экспрессиясының өзгеруімен байланысты, нәтижесінде HP1α, β және γ ақуыздары әлеуетті онкомаркерлер болып табылады. Бұл онкомаркерлердің экпрессиясының деңгейін анықтаумен қатар, оларды ақуыз-ақуыздық әрекеттесу мен интерактом талдауын жүргізу үлкен қызығушылық тудырып отыр.
Біздің жасап отырған Proximity Utilizing Biotinylation (PUB) немесе in vivo шартында ақуыздардың жақындауынан (әрекеттесуі) биотинилирлеу BirA биотин лигазасымен қызығушылық танытып отырған ақуыз және оның серіктесі BAP биотининің акцептор пептидімен рекомбинантты ақуыздың бір жасушасының ішіндегі коэкпрессияға негізделген, олардың өзара әрекеттесуі дәрежесіне нақты сандық бағалау жүргізуге мүмкіндік береді.
Жұмыстың мақсаты HP1α және HP1β ақуыз-онкомаркерлеріне in vivo шартында сандық бағалау әдісін жасау.
BirA және BAP біріккен Тар54β және HP1α, HP1β ақуыздарының экспрессиясы бойынша тәжірибе жүргізгенде, in vivo шартында гомологиялық ақуыздардың BAP-HP1 және BirА-HP1 (BAP-Тар54β және BirА-Тар54β) әрекеттесуінен, HEK293T жасушаларында биотинирлеу деңгейі жоғарылағаны анықталды. Гетерологиялық және гомологиялық әрекеттесуі белгілердің арақатынасы барлық қайталанылған тәжірибеде  (BAP-HP1α бар үлгілерде) 0,4±0,14 және (BAP-HP1β бар үлгілерде) 0,32±0,08 құрады. LC-MS/MS әдісімен экспрессирлеуші ақуыздардың белгілерінің иммуноблот аумағымен сәйкес гель үзіндісінде сандық талдау жүргізілді және BAP, Тар54β, HP1α және HP1β сәйкес пептидтер бірдейлестірілді.
Кілтті сөздер: гетерохроматин, эухроматин, ақуыз-ақуыздық әрекеттесу, биотинирлеу, онкомаркерлер, биотин лигаза, плазмидтер, транзиентті трансфекция, иммуноблот, тандемді хроматомасс-спектрометрия.